1.Метаболизм бактерий.Ферменты бактерий их классификация ,практическое использование.

Метаболизм – совокупность разнообразных ферментативных реакций,химических превращений ,происходящих в микробной клетке .Метаболизм состоит из 2 противоположно направленных,но взаимосвязанных процессов

1. Анаболизм(ассимиляция )-конструктивный обмен веществ т.е совокупность реакций для синтеза нужных компонентов клетки

2.Катаболизм (диссимиляция )- энергетический обмен ,совокупность реакций для обеспечения клетки энергией

С анаболизмом связывают питпние ,катаболизм –дыхание

У бактерий обнаружены 6 классов ферментов

1 Оксиредуктазы-катализируют ОВР

2Трансферазы –катализируют реакции переноса групп атомов

Гидролазы –катализируют гидролитическое расщепление различных соединений

Лиазы –катализируют реакции отщепления от субстрата той или иной хим.группы негидролитическими путями с образованием двойной связи или наоборот присоединение хим группы к двойным связям

Изомеразы-катализируют внутримолекулярные превращения

Лигазы или синтетазы –катализируют соединение 2 молекул ,сопряженной с расщеплением пирофосфатной связи в молекуле АТФ

По локализации ферменты делят на :экзоферменты и эндоферменты

Экзоферменты : 1. Аналоги пищеварительных ферметнов ,расщепляют крупные молекулы до более простых. 2 .Ферменты патогенности (нейраминидаза ,гиалуронидаза,плазмокоагулаза)

Эндоферменты :локализуются в цитоплазме и связаны между собой функцтонально (ферменты дыхательной цепи )

2. Питание бактерий ,типы питаний .Деление бактерий на группы по источнику углерода и энергии

Для нормальной жизнедеятельности бактерий необходимы 4 органогена : C,N,H,O

Потребность в H и O удовлетворяют через воду .По свособу углеродного питания разделяют на :

Аутотрофы –организмы которые полностью удовлетворяют свою потребность в углероде за счет минеральных соединений ,сами синтезируют компоненты клетки

Гетеротрофы- организмы которые получают углерод из различных органическиз веществ .Всвою очередь гетеротрофов подразделяют на :

Сапрофиты- использую мертвые органические субстраты

Паразиты- живут за счет живых тканей животных и растений

Бактерии способнын использовать энергию солнечного света- фототрофы

Хемотрофы получают энергию за счет ОВР

Таким образом по источнику углерода и способу получения энергии бактерии делят

1.фотоавтотрофы- углерод и неорганических соединений энергия –фотосинтез

2.фотогетеротрофы-углерод из органических соединений энергия –фотосинтез

3. хемоавтотрофы- углерод из неорганических соединений энергия –хемосинтез

Хемогетеротрофы- углерод-органические соединения энергия –хемосинте

3.Механизмы переноса питательных веществ в микробную клетку.

1)пассивная диффузия

2)облегчённая диффузия

3)активный транспорт

4)транслокационные группы или фосфотранспортный путь

1)Пассивный идёт по градиенту концентрации (из большего в меньший)прекращается когда концентрация выравнивается.Без затрат энергии и с низкой скоростью.Низкомолекулярные соединения:кислород ,вода,яды итд

2)облегчённая диффузия по градиенту концентрации без затрат энергии но с более высокой специфичностью засчет особых белков пермиаз

3)Активный транспорт преобладает у бактерий.Против градиента концентрации ,будут затраты энергии ,скорость высокая.Участвуют особые связанные белки ,локализованные в переплазматическом пространстве .Они обладают высоким сродством к определенным веществам.Функционируют в комплексе со специфическими пермиазами ,которые осуществляют перенос веществ через мембрану.

4)транслокационные группы -при этом происходит химическая модификация перенесённого вещества .глюкоза снаружи клетки в процессе внутри

4.Условия культивирования бактерий.Требования ,предъявляемые к питательным средам.

Они должны содержать все необходимые для данного вида микроба питательные вещества.

Все питательные среды должны быть влажными,стерильными.

Простые питательные среды должны быть прозрачными

Питательные среды должны иметь ph ,осмотическое давление окислительно-восстановительный потенциал ,степень насыщения кислородом.

1)По консистенции бывают :

Жидкие

Полужидкие

Плотные

2)По составу

Простые

Сложные

3)По назначению

Элективные

Дифференциально-диагностические

Транспортные

Консервирующие

Накопительные.

9.Спиртовое и молочнокислое брожение 

  Биологический смысл любого брожения состоит в том, что микробы получают энергию. Брожение-это распад углеводовс освобождением АТФ и получение какого-либо продукта брожения.  

В зависисмости от продолжительности брожения различают: спиртовое, молочно-кислое, масл-кисл, уксусно-кисл и тд. Всегда происходит в анаэробных условиях.  

Участники спиртового брожения- дрожжи.  

Saccharomyces vini 

Saccharomyces cerevisiae 

 

Участники молочно-кислого брожения 

Streptococciy lactis входит в норм. микрофлору молока и вызывает его скисление в естеств условяих. 

Lactobacillus acidophilus прим в промышл для получения молочно кислых продуктов 

 

 

10. Пигментообразование у бактерий 

 

По характеру пигментообразования бактерии делятся на две группы: 

1. Хромопарные: пигмент поступает в окр среду и является антогоническим веществом по отношению к конкурентной микрофлоре: Serratio marcescens- чудесная палочка и палочка сине зеленого гноя.  

2. Хромофорные. пигмент тесно связан с телом микробной клетки- они предохраняют от выпячивания и от УФ.   Staphylococcus aureus- золотистый стафиллокок 

sarcina flava- желтая сарцина  

Пигменты микробов могут быть: 

1. растворимыми в воде- сине зеленая палочка  

2. растворимые в спирте, но не раствр в воде- чудесная палочка  

3.  ни в воде, ни в спирте- пигменты плесени и дрожжей 

11) Процесс выделения чистой культуры можно разделить на несколько этапов.

Первый этап. Из исследуемого материала готовят мазок, окрашивают его по Граму или другим методом и микрсгскопиру-ют. Для посева исследуемый материал в случае необходимости разводят в пробирке со стерильным изотоническим раствором хлорида натрия. Одну каплю приготовленного разведения наносят петлей на поверхность питательного агара в чашку Петри и тщательно втирают шпателем в среду, равномерно распределяя материал по всей ее поверхности. После посева чашку переворачивают дном кверху, подписывают и помещают в термостат при температуре 37 °С на 18—24 ч.

Второй этап. Просматривают чашки и изучают изолированные колонии, обращая внимание на их форму, величину, консистенцию и другие признаки. Для определения морфологии клеток и их тинкториальных свойств из части исследуемой колонии готовят мазок, окрашивают по Граму и микроскопируют. Для выделения и накопления чистой культуры одну изолированную колонию или несколько различных изолированных колоний пересевают в отдельные пробирки со скошенным агаром или какой-либо другой питательной средой. Для этого часть колонии снимают петлей, не задевая соседние колонии.

Третий этап: Отмечают характер роста выделенной чистой культуры. Визуально чистая культура характеризуется однородным ростом. При микроскопическом исследовании окрашенного мазка, приготовленного из такой культуры, в нем обнаруживаются морфологически и тинкториально однородные клетки. Очнако в случае выраженного полиморфизма, присущего некоторым видам бактерий, в мазках из чистой культуры наряду с типичными встречаются и другие формы клеток.

12) Для культивирования вирусов используют культуры клеток, куриные эмбрионы и чувствительных лабораторных животных. Эти же методы используют и для культивирования риккетсий и хламидий — облигатных внутриклеточных бактерий, которые не растут на искусственных питательных средах.

Культуры клеток. Культуры клеток готовят из тканей животных или человека. Культуры подразделяют на первичные (неперевиваемые), полуперевиваемые и перевиваемые. 

Приготовление первичной культуры клеток складывается из нескольких последовательных этапов: измельчения ткани, разъединения клеток путем трипсинизации, отмывания полученной однородной суспензии изолированных клеток от трипсина с последующим суспендированием клеток в питательной среде, обеспечивающей их рост.

Перевиваемые культуры в отличие от первичных адаптированы к условиям, обеспечивающим им постоянное существование invitro, и сохраняются на протяжении нескольких десятков пассажей.

Перевиваемые однослойные культуры клеток приготовляют из злокачественных и нормальных линий клеток, обладающих способностью длительно размножаться invitro в определенных условиях. К ним относятся злокачественные клетки HeLa, первоначально выделенные из карциномы шейки матки, Нер-3 (из лимфоидной карциномы), а также нормальные клетки амниона человека, почек обезьяны и др.

К полуперевиваемым культурам относятся диплоидные клетки человека. Они представляют собой клеточную систему, сохраняющую в процессе 50 пассажей (до года) диплоидный набор хромосом, типичный для соматических клеток используемой ткани. Диплоидные клетки человека не претерпевают злокачественного перерождения и этим выгодно отличаются от опухолевых.

О размножении (репродукции) вирусов в культуре клеток судят по цитопатическому действию (ЦПД), которое может быть обнаружено микроскопически и характеризуется морфологическими изменениями клеток. 

Характер ЦПД вирусов используют как для их обнаружения (индикации), так и для ориентировочной идентификации, т. е. определения их видовой принадлежности.

Один из методов индикации вирусов основан на способности поверхности клеток, в которых они репродуцируются, адсорбировать эритроциты — реакция гемадсорбции. Для ее постановки в культуру клеток, зараженных вирусами, добавляют взвесь эритроцитов и после некоторого времени контакта клетки промывают изотоническим раствором хлорида натрия. На поверхности пораженных вирусами клеток остаются прилипшие эритроциты.

Другой метод — реакция гемагглютинации (РГ). Применяется для обнаружения вирусов в культуральной жидкости культуры клеток либо хорионаллантоисной или амниотической жидкости куриного эмбриона. 

Количество вирусных частиц определяют методом титрования по ЦПД в культуре клеток. Для этого клетки культуры заражают десятикратным разведением вируса. После 6—7-дневной инкубации их просматривают на наличие ЦПД. За титр вируса принимают наибольшее разведение, которое вызывает ЦПД в 50 % зараженных культур. Титр вируса выражают количеством цитопатических доз.

Более точным количественным методом учета отдельных вирусных частиц является метод бляшек. 

Некоторые вирусы можно обнаружить и идентифицировать по включениям, которые они образуют в ядре или цитоплазме зараженных клеток.

Куриные   эмбрионы.   Куриные   эмбрионы   по   сравнению с культурами клеток значительно реже бывают контаминированы вирусами и микоплазмами, а также обладают сравнительно высокой жизнеспособностью и устойчивостью к различным воздействиям.

Для получения чистых культур риккетсий, хламидий и ряда вирусов в диагностических целях, а также для приготовления разнообразных препаратов (вакцины, диагностикумы) используют 8—12-дневные куриные эмбрионы. О размножении упомянутых микроорганизмов судят по морфологическим изменениям, выявляемым после вскрытия эмбриона на его оболочках.

О репродукции некоторых вирусов, например гриппа, оспы, можно судить по реакции гемагглютинации (РГА) с куриными или другими эритроцитами.

К недостаткам данного метода относятся невозможность обнаружения исследуемого микроорганизма без предварительного вскрытия эмбриона, а также наличие в нем большого количества белков и других соединений, затрудняющих последующую очистку риккетсий или вирусов при изготовлении различных препаратов

13.Идентификация бактерий по биохимическим признакам с помощью сред "пестрого ряда".

1.Чистую культуру исследуемого микроорганизма засевают петлей в среды "пестрого ряда".

2.Посевы инкубируют при 37° С в течение 18—24 ч или больше.

3.В том случае, если бактерии ферментируют углевод до образования кислых продуктов, наблюдается изменение цвета среды;

4.При разложении углевода до кислоты и газообразных продуктов наряду с изменением цвета появляется пузырек газа в поплавке.

5.Если используют среды с полужидким агаром, то образование газа регистрируется по разрыву столбика.

При отсутствии ферментации цвет среды не меняется. Поскольку бактерии ферментируют не все, а только определенные для каждого вида углеводы, входящие в состав сред Гисса, наблюдается довольно пестрая картина, поэтому набор сред с углеводами и цветным индикатором называют "пестрым рядом».

14.Способы размножения бактерий

Бактериальные клетки размножаются в результате деления. Основные стадии размножения микробов в жидкой среде в стационарных условиях:

- лаг- фаза (начальная стадия адаптации с медленным темпом прирости биомассы бактерий);

- экспоненциальная (геометрического роста) фаза с резким ростом численности популяции микроорганизмов (2 в степеии n);

- стационарная фаза (фаза равновесия размножения и гибели микробных клеток);

- стадия гибели - уменьшение численности популяции в связи с уменьшением и отсутствием условий для размножения микроорганизмов (дефицит питательных веществ, изменение рH, rH₂, концентрации ионов и других условий культивирования).

Данная динамика характерна для периодических культур с постепенным истощением запаса питательных веществ и накоплением метаболитов.

Если в питательной среде создают условия для поддержания микробной популяции в экспоненциальной фазе- это хемостатные (непрерывные) культуры.