26.Нормальная и фитопатогенная микрофлора растений .Источники и пути загрязнения лрс.Мптоды контроля микробной чистоты лрс.Требования,предъявляемые к категориям 4а и 4б

В норме на поверхности живых растений (на листьях, стеблях, плодах, се-менах) обитают микроорганизмы, которые называются эпифитной микрофлорой.

Эпифитная микрофлора не наносит вреда и препятствует проникновению фитопатогенных микробов в растительные ткани (антагонистическое действие). К эпифитной микрофлоре относятся: грам «-» бактерии Erwinia herbicola (на МПА образует золотисто-желтые колонии), грам«-» полиморфная палочка Pseudomonas fluorescens (на МПА – прозрачные колонии с флюоресценцией), спорообразующие бактерии – Bacillus mesentericus, Bacillus vulgatus, бесспоровые бактерии – Bacterium putidam, E. сoli, а также небольшое количество грибов.

Внутри растения бактерии могут распространяться 2-мя путями: 1) межклеточный путь; такие заболевания называются паренхиматозными; 2) по сосудам; бактерии закупоривают сосуды, поэтому растения увядают; такие заболевания называются сосудистыми.

Основные роды бактерий - возбудителей инфекционных заболеваний растений:

Род Erwinia - вызывает болезни типа ожога, увядания, мокрой или водяни-стой гнили.

Род Pseudomonas – вызывает бактериальную пятнистость (на листьях обра-зуются пятна различной окраски и размеров).

Род Xanthomonas – вызывает сосудистые бактериозы (закупорка сосудов, увядание и гибель), поражает листья, вызывает пятнистость.

Род Corynebacterium – сосудистые и паренхиматозные заболевания, бакте-риальный рак.

Род Agrobacterium – вызывает образование опухолей (корончатые галлы).

Род Pectobacterium – вызывает преимущественно гнили растений.

К вирусным заболеваниям растений относятся мозаичные болезни, желту-хи, болезнь увядания, карликовость, закукливание и др.

Грибные болезни растений – микофитозы: фузариозы, гнили, аскохитозы, головни и др.

Методы контроля микробной чистоты растительного сырья.

Для оценки микробной обсемененности растительного сырья используется метод смывов. В асептичных условиях, используя стерильные инструменты, взвешивают 1 г сырья, помещают в стерильную пробирку с 5 мл изотонического раствора хлорида натрия и встряхивают на шуттель-аппарате в течение 10 мин; берут 1 мл смыва, делаю разведения 1:10, 1:100; из каждого разведения делают посев 1 мл в глубину питательной среды в чашках Петри. Для выявления роста грибов и дрожжей используют среду Сабуро или сусло-агар, для выявления бактерий – МПА. При этом засевают 2-3 параллельные чашки на каждое разведение. Оставляют в термостате при 37С для бактерий и при 24С для грибов и дрожжей, подсчитывают число выросших колоний и, зная разведение смыва, подсчитывают микробную загрязненность сырья. Микробную загрязненность лекарственного сырья выражают количеством клеток микроорганизмов в 1 г сырья.

Микроорганизмы могут загрязнять и различные готовые лекарственные препараты. В готовые лекарственные препараты микробы попадают:

1) из растительного лекарственного сырья (нормальная и фитопатогенная микрофлора растений);

2) из окружающей среды во время изготовления лекарственных препаратов в аптеках и на фармацевтических фабриках.

Источники микробного загрязнения лекарственных препаратов:

1. лекарственные растения; 2) вода 3) аптечная посуда, оборудование и пр.; 4) воздух производственных помещений; 5) руки персонала. Микроорганизмы могут попадать в лекарственные средства в процессе неправильного анализа, особенно органолептического.

27,Источники и пути загрязнения лек.средств.(см.выше).Способы предупреждения загрязнения.Методы бактериологического контроля стерильных и нестерильных ЛС.Требования,предъявляемые к категориям 2,3А,3Б и 3В.

нестерильных лекарственных средствах.

Методы определение микробной загрязненности лекарственных средств, не обладающих антимикробным действием.

От каждой серии препарата отбирают 10 проб из 10 разных упаковок, в це-лом не меньше 50 г или мл Если лекарственное средство обладает антимикробным действием, то стерильность определяют путем мембранной фильтрации. После фильтрации исследуемого препарата фильтр делят на части и вносят для роста задержанных микроорганизмов в жидкие питательные среды. При отсутствии роста препарат счи-тается стерильным. Определение общего количества бактерий и грибов. 10 г (мл) разводят в 10 раз 0,1 М раствором фосфатного буфера, доводя конечный объем до 100 мл. Де-лают посев по 1 мл разведенного препарата двухслойным агаровым методом в 2 чашки Петри с МПА, содержащим 0,1% глюкозы для определения бактерий и по 1 мл в 2 чашки Петри со средой Сабуро с антибиотиками для грибов. Чашки с МПА для определения бактерий инкубируют при 37С 5 дней, а со средой Сабуро для определения грибов при 24С 5 дней. Затем подсчитывают число колоний, находят среднее арифметическое для 2-х чашек и высчитывают количество бактерий и гри-бов в 1г (мл) отобранного на анализ образца.

Определение бактерий семейства Enterobacteriaceae. Следующие 10 г(мл) образца вносят в 90 мл среды обогащения, перемешивают и инкубируют при 37С 24 – 48 час. При наличии роста делают пересев на среду Эндо и висмут-сульфитный агар. Инкубируют при 37С 24 – 48 час. На среде Эндо бактерии семейства Enterobacteriaceae образуют малиновые колонии с металлическим блеском. На висмут-сульфитном агаре – черные или зеленовато-бурые, светло-зеленые или коричневые колонии. Колонии исследуют микроскопически и выявляют грам «-» неспоровые палочки. Подозрительные колонии пересевают на скошенный в пробирках МПА с 0,1% глюкозой и инкубируют при 37С 24 час. Из каждой пробирки с чистой культурой делают пересевы на :

1) среду с глюкозой и феноловым красным ( энтеробактерии ферментируют глюкозу и среда становится желтой);

2) среду с нитратом калия (энтеробактерии восстанавливают нитраты в нитриты и не имеют фермента цитохромоксидазы).

Если в образце обнаружены грам «-» неспоровые палочки, которые дают отрицательную реакцию на цитохромоксидазу, ферментируют глюкозу и восстанавливают нитраты в нитриты, то делают вывод, что исследуемый препарат содержит бактерии семейства Enterobacteriaceae.

Определение бактерий S. aureus и P. aeruginosa. Следующие 10 г(мл) об-разца вносят в 90 мл накопительной среды и инкубируют при 37С 24 – 48 час. При наличии роста делают пересев петлей на чашки Петри с солевым агаром с маннитом для стафилококка и на чашки Петри со средой для идентификации синегной палочки. Инкубируют при 37С 24 – 48 час. Стафилококк на солевом агаре образует желтые колонии, окруженные желтыми зонами. При микроскопии обнаруживаются грам"+" кокки. С чистой культурой стафилококка ставят реакцию плазмокоагуляции. Для этого в пробирку с 0,5 мл разведенной (1:4) плазмой крови человека или кролика вводят петлю агаровой культуры стафилококка и инкубируют 1-24 час при 37С. Стафилококк коагулирует плазму.

P. aeruginosa на диагностической среде образует зеленые флюоресцирую-щие колонии. Их идентифицируют микроскопически и биохимически. Под микро-скопом бнаруживают грам «-» палочки. Реакция на цитохромоксидазу положитель-на (бумажка с индикатором синеет).

Нормативы. В нестерильных лекарственных средствах для приема внутрь в 1 г (мл) должно быть не более 1000 бактерий и 100 дрожжевых и плесневых грибов, а также должны отсутствовать патогенные и условно-патогенные микроорганизмы - представители семейства энтеробактерий, синегнойная палочка и золотистый стафилококк.

Лекарственные средства для местного применения (полость уха, носа, ин-травагинально) не должны содержать более 100 (суммарно) микробных клеток в 1 г (мл).

В таблетированных препаратах не должно быть патогенной микрофлоры, а общая обсемененность не должна превышать 10 тыс. микробных клеток на 1 таб-летку.

Бактериологический контроль соблюдения санитарно-гигиенического режима изготовления лекарственных препаратов на предприятиях и в аптеках осу-ществляется исследованиями смывов с рук персонала, посуды, поверхности столов, оборудования. Смывы высевают на различные питательные среды и определяют общую микробную обсемененность, наличие кишечной палочки, золотистого ста-филококка, патогенных энтеробактерий, грибов рода Сandida, энтеровирусов.

Лекарственные средства, не требующие стерилизации, содержат микроор-ганизмы. Но их содержание не должно превышать предельно допустимых значений для различных лекарственных форм.

Оценка микробной загрязненности нестерильных препаратов.

Определяют:

1) количество жизнеспособных бактерий в 1 г или 1 мл препарата;

2) количество жизнеспособных грибов в 1 г или 1 мл препарата;

3) кишечную палочку и представителей семейства энтеробактерий, сине-гнойную палочку и золотистого стафилококка, которые не должны присутствовать в нестерильных лекарственных средствах.. На анализ берут 30 г т(мл), разделив на 3 части по 10 г (мл).