4) Техника иммерсионной микроскопии.

Иммерсионная система (от позднелат. immersio — погружение) — оптическая система, в которой пространство между предметом и первой линзой заполнено иммерсионной жидкостью.

В качестве последней применяют кедровое или минеральное масло (показатель преломления 1,515); водный раствор глицерина (1,434); воду (1,333); монобромнафталин (1,656); вазелиновое масло (1,503); йодистый метилен (1,741). Оптические характеристики иммерсионной жидкости (показатель преломления и дисперсия) входят в аберрационный расчет объективов микроскопа и учитываются при определении оптических параметров объектива (увеличение, числовая апертура), а также при аберрационной коррекции (исправление по полю, ахроматизация, исправление хроматических и сферических аберраций).

Иммерсионное масло. Первая иммерсионная жидкость была получена из природного кедрового масла. С течением времени на воздухе происходило уплотнение жидкости, что изменяло показатель преломления, до постепенного превращения ее в смолу и отвердения. Сейчас применяется исключительно синтетическое иммерсионное масло с неизменным показателем преломления. Оно не превращается в смолу и поэтому может долго храниться. Годом введения в серийный микроскоп рассчитанного объектива масляной иммерсии считается 1878 г

5.1)Особенности строения спирохет,актиномицетов,риккетсий,хламидий и микоплазм.

Спирохеты (лат. Spirochaetales) — порядок бактерий с длинными (3—500 мкм) и тонкими (0,1—1,5 мкм) спирально (греч. σπειρα «завиток») закрученными (один и более виток спирали)клетками. Грамотрицательны, хемоорганогетеротрофы. Подвижны, размножаются поперечным делением. Эндоспор не образуют. Встречаются как аэробные виды, так и анаэробные и факультативно-анаэробные. Спирохеты встречаются в почве, воде, других организмах Клетки состоят из протоплазматического цилиндра с одной или несколькими так называемыми осевыми фибриллами, отходящими от расположенных на концах клетки прикрепительных цилиндров. Протоплазматический цилиндр с осевыми фибриллами покрыт внешней оболочкой.

Строение и роль актиномицетов

 Царство Bacteria

Отдел Firmicutes

Класс Thallobacteria

Порядок Actinomycetales

Представители: Actinomyces, Streptomyces, Nocardia

Mycobacterium tuberculosus.

Актиномицеты (лучистые грибки) - это прокариоты, образующие Мицелий (грибницу) - тело, состоящее из тонких ветвящихся нитей –гиф диаметром 0,1 мкм (рис.14). Мицелий актиномицетов обычно снежно-белого цвета, реже образуются пигменты, которые выделяются в окружающую среду. Мицелий актиномицетов чаще состоит из воздушной и субстратной частей. Субстратный мицелий погружен в питательную основу - субстрат и служит для питания. Воздушный мицелий находится над субстратом и служит для размножения. Цитологические актиномицеты - типичные прокариоты. Тело одноклеточное, имеется Нуклеоид, Мезосомы, рибосомы 70S-типа. Клеточная стенка грамположительная, содержит до 90% Пептидогликана (муреина). Размножение чаще спорами. На кончиках воздушного мицелия имеются различного вида спороносцы (рис.15), в которых образуются споры двумя основными способами: Фрагментацией и сегментацией. ПриФрагментации Гифы распадаются на палочковидные и кокковидные клетки, из которых образуются споры. Значение актиномицетов

1). Минерализаторы органического вещества в природе, компоненты круговорота веществ.

2).Участвуют в системе гумусообразования.

3).Используются для получения антибиотиков.

4).Вызывают болезни животных и человека - Актиномикозы (ту-беркулез, проказа)

Риккетсии – микроорганизмы размером от 0,2 до 30 мкм. Они имеют обычное для бактерий строение клетки: двуслойную оболочку, цитоплазму, нуклеотид. По форме риккетсии могут быть палочковидными, нитевидными и кокковидными. Все риккетсии внутриклеточные паразиты, т.е. могут развиваться только в клетках живого организма. Они вызывают такие инфекционные заболевания, как сыпной тиф и различные лихорадки. Переносчиками риккетсий являются членистоногие: клещи, вши и блохи, в организме которых риккетсии размножаются.

Строение хламидий

По своей структуре хламидии имеют вид маленьких кокков. Они имеют уникальный цикл развития, который включает в себя две абсолютно разные формы существования: Элементарные тельца и Ретикулярные тельца. Эти формы отличаются как строением, так и биологическими свойствами. У Элементарных телец особенно развиты инфекционные свойства, они способны легко проникать в клетку. Элементарным тельцам предшествуют ретикулярные, они большего размера и не имеют постоянной структуры, кроме того, эта форма хламидий не содержит ядра и не обладает инфекционными свойствами.

Микоплазмы отличаются от остальных бактерий отсутствием жёсткой клеточной стенки (в результате чего от внешней среды их отделяет лишьцитоплазматическая мембрана) и ярко выраженным полиморфизмом. От вирусов микоплазмы отличаются способностью расти на бесклеточных средах и способностью метаболизировать ряд субстратов. Так, для роста микоплазме необходимы стеролы, например, холестерин. Микоплазмы содержат одновременно ДНК и РНК, а также чувствительны к некоторым антибиотикам.

В культуре одного вида можно выделить крупные и мелкие шаровидные, эллипсообразные, дисковидные, палочковидные и нитевидные, в том числе ветвящиеся (из-за этого все микоплазмы одно время причислялись к актиномицетам), клетки. Описаны и разные способы размножения: фрагментация, бинарное деление, почкование. При делении полученные клетки не равноценны по размеру, часто одна из них даже нежизнеспособна. К микоплазмам относятся формы с самыми мелкими из известных клеточных микроорганизмов размерами, в том числе меньше теоретического предела самостоятельного воспроизводства на питательной среде (этот предел для сферических клеток составляет 0,15—0,20 мкм а для нитевидных — 13 мкм в длину при 20 нм в диаметре).

2)Методы их обнаружения.

Спирохет.Из методов окраски наиболее употребителен способ Романовского-Гимза (Giernsa). Тонкие мазки тканевой жидкости отделяемого из язвы или эрозии, нанесенные на предметные или покровные стекла, высушивают на воздухе, затем фиксируют абсолютным алкоголем или смесью Никифорова. После этого мазки окрашивают только что приготовленной смесью-—10—15 капель краски Романовского-Гимза с 10 мл дестиллированной воды— в течение 2—-12 часов, ополаскивают водой, высушивают и исследуют под микроскопом с иммерсионной системой.

Еще проще метод Нитше (Nitsche). Высушенный на воздухе мазок из чистой тканевой жидкости заливают на 3 минуты 2% раствором колларгола. После этого краска сливается (не споласкивается водой), препарат высушивается и исследуется иммерсионной системой. На золо-тистооранжевом фоне бывают ясно видны бесцветные спирохеты

Актиномицеты. Наиболее распространённый метод лабораторной диагностики актиномицетов — обнаружение друз A. israelii в экссудате или гнойном отделяемом из очагов поражения. Последние могут достигать значительных размеров, образуя так называемые серные гранулы или тельца Боллингера размером в среднем 0,3-2 мм. Для поиска более мелких друз исследуемый материал (гнойное отделяемое, мокрота, биоптаты и СМЖ) помещают на предметное стекло в каплю 10-20% раствора КОН или NaOH, подогревают, покрывают покровным стеклом и микроскопируют.

Друзы актиномицетов имеют плотную, каменистую консистенцию и скрипят как песок при надавливании на покровное стекло. Друзы актиномицетовтакже можно исследовать методом «раздавленной» капли либо в препаратах, окрашенных по Романовскому-Гимзе или Граму. Они образованы агрегатами мицелия, имеющими вид округлых или овальных базофильных масс с эозинофильными включениями (очевидно, что это AT) на поверхности.

• Для выделения чистых культур актиномицетов проводят посев на кровяной и сывороточный агары, среды Сабуро или Чапека. Посевы актиномицетов инкубируют в аэробных и анаэробных условиях в течение 1 -2 нед.

• Важное значение имеют иммунологические исследования: кожная проба с актинолизатом, оценка ответа иммунокомпетентных клеток на актинолизат in vitro

Риккетсии. Большое значение для морфологического их изучения имеют специальные методы окраски риккетсии, среди которых отличается своей информативностью метод Д.Л. Романовского с использованием красящего раствора Гимзы. Этот метод позволяет обнаружить все виды и формы вне- и внутриклеточных риккетсии, а также выявить их микроструктуру, отличающуюся большим морфологическим разнообразием. По своей морфологии они могут быть четырех типов: Тип а - округлые, овоидные или эллипсовидные образования размером 0,2-0,5 мкм, в которых при окраске по Романовскому видна зернистость; тип b - короткие палочковидные риккетсии длиной 0,75-2,5 мкм, шириной около 0,3 мкм, двузернистые с полярным расположением зерен; тип с - длинные палочковидные образования до 3-5 мкм слегка изогнутые, иногда трех-, четырехзернистые; тип d - нитевидные (мицеллярные) риккетсии в виде длинных изогнутых нитей размером 8-10-40 мкм с множественной зернистостью, трудно дифференцируемой.

Кроме метода Романовского, используют методы импрегнации серебром по М.А. Морозову, окраску по Маккиавелло в модификации П.Ф. Здродовского и др

Хламидии. Существуют следующие основные методы обнаружения хламидий:  1. иммунофлюоресцентный,  2. иммуноферментный,  3. серологический,  4. методы выделения возбудителя в культуре клеток и метод полимеразной цепной реакции (ПЦР) 

Микоплазмы

Существуют следующие основные методы обнаружения хламидий:  1. иммунофлюоресцентный,  2. иммуноферментный,  3. серологический,  4. методы выделения возбудителя в культуре клеток и метод полимеразной цепной реакции (ПЦР)