4. Микроклональное размножение цветочных культур

Иначе этот способ размножения называется методом изоли­рованных тканей. Метод изолированных тканей начал развивать­ся в конце XIX — начале XX в. X. Фехтингом, К. X. Рехингером, Г. Габерландтом.

Длительный период велись исследования по подбору питательной среды для выращивания изолированных высокоспециализи­рованных тканей, которые были неудачными из-за характера выращиваемых тканей. Только в 1932 г. Р. И. Готре во Франции и Ф. Уайт в США независимо друг от друга добились положитель­ных результатов в этих исследованиях, удачно подобрав состав питательной среды и выращиваемую ткань — меристему корня томата.

В 1952 г. Г. М. Морэль и К. Картин получили безвирусные рас­тения из меристемы, взятой от зараженного растения табака. Пос­ле этих опытов метод верхушечной меристемы стали применять с целью оздоровления растений, зараженных вирусами. Среди наи­более значительных были работы, проведенные на декоративных растениях — хризантемах, орхидеях, фрезии, ирисе, луковичных и, главное, на американских сортах крупноцветковой ремонтант­ной гвоздики.

В настоящее время метод культуры изолированных тканей растений нашел широкое применение не только для получения безвирусных растений, но и для быстрого размножения сортов, у которых при семенном размножении не получается стабильного по декоративным качествам потомства (гербера), а также с целью получения от исходных сортов растений со сортовыми отклоне­ниями. Возникновение сортов при этом обусловлено мутаген­ным действием регуляторов роста, которые могут вызывать полиплоидизацию растущих каллюсных клеток. Для этого используют не только апикальную меристему растений, но и части листьев, и цветоносов, цветков (пыльники, цветоложе).

Для выращивания изолированных тканей требуется определенный микроклимат в культивационных помещениях, стерильность всех инструментов и питательных сред, система контроля за каче­ством получаемого материала (вирусная стерильность, сохранение сорта).

Выращивание изолированных тканей делят на четыре этапа:

1. эксплантация (вычленение) исходной ткани растения; на этом этапе необходимо получить свободную от видимой инфек­ции ткань, добиться ее выживания и быстрого роста;

1. собственно микроразмножение, при котором нужно обес­печить увеличение количества микрочеренков;

2. укоренение полученных микропобегов и сохранение их в прохладном помещении;

3. закаливание растений, повышение их устойчивости к внеш­ней среде.

Метод выращивания изолированных тканей включает: приготовление и стерилизацию питательной среды; подготовку и стерилизацию растительного материала и обору­дования на этапе вычленения тканей; изоляцию и посадку кусочков тканей на питательную среду; выращивание ткани в термостатированных условиях (получе­ние растений-регенератов); пересадку растений в оранжерейные субстраты и выращивание из них маточных растений в условиях, исключающих возможность вирусного инфицирования; проверку растений на наличие вирусных заболеваний и отбор здоровых растений; получение здорового посадочного материала от здоровых ма­точников.

Для выращивания изолированных тканей необходимы специа­лизированные помещения: комнаты для стерилизации сред и для мойки посуды; боксы для изоляции, пересадки тканей и деления растеньиц; термостатная для выращивания изолированных тка­ней и укоренения микрочеренков.

В термостатной температуру воздуха поддерживают в пределах ±2 °С от оптимальной для конкретного вида. Декоративные расте­ния по отношению к температуре в период выращивания их методом культуры тканей делят на три группы. Оптимальные пределы температур для этих групп равны 20 — 22, 22—27 и 28 —29 °С. По­этому в термостатной температура должна регулироваться в пре­делах от 20 до 29 "С. Оптимальная относительная влажность возду­ха 70 %. Более высокая относительная влажность воздуха может привести к увлажнению ватных пробок и инфицированию куль­тур в пробирках, а более низкая — к высыханию среды, или к изменению концентрации солей в жидкой среде. Воздух в термостатной должен быть чистым, без посторонних при­месей. Освещение обеспечивается люминесцентными лампами. При использовании других источников важно учитывать их теплоотда­чу, так как при высокой теплоотдаче может наблюдаться перегрев культур. Освещенность 1 —2 тыс. лк.

Важнейший элемент технологии культуры растительных тка­ней — питательная среда. В результате многочисленных исследова­ний с разными видами растений создано много сред, агаризованных полутвердых и жидких. Большинство из них включают в себя минеральные макро- и микроэлементы, углеводы, витамины, ами­нокислоты, регуляторы роста. Наиболее часто используют среды Уайта, Мореля, Мурасиге—Скуга, Линсмейера—Скуга, Буюса.

Все среды содержат регуляторы роста — ауксины и цитокинины, без которых изолированные клетки нормальных растений не могут расти на искусственных средах. Из всех разработанных сред среда Мурасиге — Скуга наиболее универсальна и эффективна для большинства декоративных культур. Однако для каждого вида раз­рабатывают собственные модификации сред.

Развитие кусочка ткани на среде может происходить двумя пу­тями:

1. непосредственно образуется проросток и из него растень­ице;

1. образуется каллюс, который затем пересаживают (пассиру­ют) на другую среду, где он дает начало побегам.

Развитие растительной ткани в пробирках зависит от разных причин: размеров выделенной апикальной меристемы (гвоздика), соотношения в питательной среде регуляторов роста и условий, в которых находятся растения.

Для получения растений-регенератов важно обеспечить по­следовательность прохождения фаз органогенеза. Первая фаза ор­ганогенеза — переход недифференцированной растущей ткани к образованию регенерационной меристемы и закладке стеблевых точек роста. Эта фаза обеспечивается преобладанием в среде цитокининов над соединениями с ауксиновой активностью. Вторая фаза органогенеза — переход возникших образований к активно­му формированию побегов и корней. Для этой фазы необходима среда с относительно низким количеством (по сравнению со средой Мурасиге—Скуга) минеральных солей и содержанием веществ с ауксиновой активностью. Отбор соответствующей питательной среды для прохождения первой и второй фаз органогенеза — наи­более сложная и важная задача. Для каждого вида, а иногда и сорта эту задачу решают отдельно, что служит причиной много­образия питательных сред (прил. 3).

В настоящее время метод культуры изолированных тканей рас­тений нашел широкое применение в мире. В нашей стране он на­чал развиваться с конца 50-х гг. XX в., когда в Институте физиоло­гии растений им. К. Е. Тимирязева была создана лаборатория куль­туры изолированных растительных тканей и органов. Сейчас такие лаборатории имеются в Научно-исследовательском институте гор­ного садоводства и цветоводства (Сочи), в Научно-исследователь­ском зональном институте садоводства Нечерноземной полосы (Москва). Этот метод используется во многих цветоводческих хо­зяйствах, где имеются промышленные лаборатории: Московском оранжерейном комплексе (Одинцово), колхозе им. С.М.Кирова Балашихинского района, совхозе .«Победа» (Клин).