5.7.Атомно-силовые измерения в биологических системах

Измерения зависимости сила—расстояние, выполняемые с помо­щью атомно-силового микроскопа (также известные под названием атомно-силовой спектроскопии), играют важную роль в исследованиях биологических систем. Измерение типа сила—расстояние начинается с того, что наконечник АСМ сближают с поверхностью образца. Когда наконечник слишком близко подходит к поверхности, механическая неустойчивость вызывает его прилипа­ние к поверхности. При проникновении наконечника в образец начинает про­являться квантово-механическое отталкивание атомов, и в этот момент нако­нечник начинают отрывать от поверхности. Адгезия наконечника к поверхно­сти приводит к гистерезису: кривая отрыва не совпадает с кривой сближения. В частности, чтобы отделить наконечник от поверхности, необходимо поднять его несколько выше точки первоначального контакта. В конечном итоге нако­нечник отделяется от поверхности, а нагрузка непосредственно перед момен­том отрыва называется силой отрыва, или силой адгезии.

Выполнено множество экспериментов такого типа на биологических сис­темах. В качестве примера рассмотрим биотинилированный бычий сывороточ­ный альбумин (БСА), адсорбированный на стеклянных микросферах, закреп­ленных на кантилевере АСМ, с помощью которого было исследовано взаимодействие со стрептавидином, нанесенным на поверхность слюды, как показано на рис. 5.26. Другой пример заключается в исследовании механизма распознава­ния биотин-стрептавидин типа «ключ—замок» с помощью биотинилированной агарозы и покрытого стрептавидином наконечника. Исследования заключа­лись в измерении силы отрыва, по которой рассчитывалось соотношение меж­ду силой взаимодействия и энтальпией. Еще один пример представляет собой исследование сил распознавания между комплементарными нитями ДНК.

Нити ДНК тиолируются по их концевым группам 3' и 5' (каждая из нитей ДНК заканчивается гидроксильной (3') группой с одной стороны и фосфолатной (5') группой — с другой; в двойной спирали ДНК с каждого конца распо­ложены комплиментарные группы 3' и 5'), по которым присоединяются ал-килсилановые монослои, закрепленные на кремниевом зонде и на плоской подложке. Небольшое видоизменение данного подхода, состоящее в присо­единении оснований к наконечнику и поверхности, позволило исследовать вза­имодействие пар оснований. Позднее этот эксперимент был адаптирован для разработки сенсоров. И наконец, последний пример состоит в исследовании сил взаимодействия пептидных нуклеиновых кислот (ПНК), модифицирован­ных цистеином, чтобы присоединить их к покрытым золотом наконечникам АСМ, с алкантиоловыми монослоями до и после гибридизации с ПНК или РНК. Оказалось, что гибридизация снижает силу отрыва. В качестве зонда для исследования микронных структурированных массивов закрепленных на под­ложке олигонуклеотидов используют ДНК-модифицированные латексные мик­рочастицы.

Перечисленные примеры указывают на потенциальную применимость ме­тодик, основанных на высокочувствительных исследованиях распознавания с помощью АСМ. Поле деятельности биологических атомно-силовых измерений на основе СЗМ постоянно расширяется. Атомно-силовая спектроскопия стала более или менее признанным методом биофизических исследований, хотя ин­терпретация данных остается весьма сложной и вызывает большие споры в научном сообществе. Необходимо подчеркнуть, что сложность таких явлений как разворачивание белка означает, что практикующие биологическую атом-но-силовую микроскопию вынуждены решать самые разнообразные техничес­кие вопросы, которые не играют существенной роли в случае более простых систем. Одним из таких вопросов могут быть явления, зависящие от скорости. Было показано, что приложение внешней механической силы эффективно на­клоняет «энергетический ландшафт» процесса разворачивания, тем самым по­нижая энергию активации. В связи с этим приходится исследовать разворачи­вание белка в некотором диапазоне скоростей разгрузки, только так можно добиться точной оценки характерных величин. Данная методика была адапти­рована на случай широкого круга различных явлений.

Применение АСМ при изучении клеточных структур и их функций состав­ляет серьезную экспериментальную проблему. В частности, это объясняется тем, что клетки представляют собой довольно мягкую структуру. Клеточная мембрана состоит из бислоя липидных молекул, а содержимое клетки находит­ся в жидком виде. Однако, АСМ предоставляет возможность зондирования клеточных свойств и взаимодействий с очень высоким пространственным раз­решением. Недавние работы показали, что результаты могут быть впечатляю­щими. Проведены чрезвычайно элегантные исследования клеточных структур, показавшие возможность применения АСМ для получения структуры макро­фагов печени крыс и кардиоцитов курицы. Актин является небольшим белком, который организуется в волокнистые структуры, благодаря которым происхо­дит сцепление клеток друг с другом. Процесс образования стрессорного волок­на связан с образованием фокальных спаек, которыми клетки крепятся к субстрату, на котором происходит их культивация. С помощью АСМ были измерены механические свойства актинового стрессорного волокна, а также получено его изображение. Оказалось возможным выполнить измерения на подвижных клетках (рис. 5.27) и даже зарегистрировать различия между активными и ста­бильными кромками подвижных фибробластов. Неожиданно хорошо разре­шенные изображения были получены при исследовании клеток микробов. Также удалось провести измерения типа сила—расстояние на поверхности клеток и сравнить адгезию поверхностей клеток различных микробов. При варьирова­нии рН растворов, в которых производится измерении сил отрыва, стало воз­можным исследовать распределение заряда по поверхности клетки.

Рис. 5.27. (Кнеточная динамика, сня­тая в реальном времени с помощью АС М. На рисунке (а) ясно видно раз­мытие нижней кромки клетки, кото­рое через 15 мин полностью превра­щается в плоскую ламеллилодию (б). Одновременно с этим происходит вытягиваЕ[ие верхней части клетки и возрастание ее высоты. Через 50 мин все ламеллиподии вытянуты, а клетка снова принимает круглую форму (s). Через 75 мин клетка готова к сле­дующему перемещению {г). Воспро­изведено с разрешения С. Rotsch, F. Braet, Е. Wisse and М. Radmacher, Cell Biol. Intl. 21, 685 (1997)

Альтернативой ACM при исследовании сил взаимодействия в биологичес­ких системах может стать оптический пинцет. Принцип его действия основан на захвате диэлектрической частицы лазерным лучом, как показано на рис. 5.28. Крайне высокий градиент электрического поля вблизи сильно сфокусирован­ного лазерного луча оказывает механическое воздействие на диэлектрическую частицу с силой, которая тянет ее к центру луча и толкает в направлении рас­пространения. Несмотря на то, что можно использовать два встречных луча, тем более что и название подразумевает наличие двух половин пинцета, тем не менее вполне достаточно и одного луча, что и реализуется в типичных современ­ных установках. Диаметр частицы критичен и должен составлять около 1 мкм. Ее обычно изготавливают из полимера. С помощью оптического пинцета не­возможно создать ловушку для уединенной молекулы, поэтому в биологи­ческих исследованиях используют функционализированный шарик. Несмотря на все ограничения, метод является очень мощным.

Было исследовано механическое действие молекул при сокращении мышц. Когда мышца сокращается, миозин натягивает актиновые волокна (белковые волокна, скрученные из молекул актина). Для исследования данного действия актиновое волокно было закреплено между двумя микросферами (см. рис. 5.28.). Затем волокно помещали вблизи третьей микросферы, покрытой миозином. Вся установка была погружена в раствор, содержащий аденозинтрифосфат (АТФ), который служил топливом для биологических молекул. Во время кон­такта между миозином и актином происходит усвоение молекулы АТФ, а на актиновом волокне возникает натяжение. С помощью оптического пинцета измеряется сила, действующая на один из шариков. Установлено влияние кон­центрации АТФ на скорость процесса смещения.

Рис.5.28.

С помощью оптического пинцета было исследовано взаимодействие между ФН и цитоскелетом клетки. Короткий сегмент ФН, содержащий домен присоединения к клетке, был закреплен на кварцевом шарике, затем приведен во взаимодействие с клеткой. Шарик соединяется с одним из интегриновых ре­цепторов a_vP_y способным распознавать участок молекулы ФН, содержащий RGD-последовательность. Когда шарик закрепляется на подвижной ламелли-подии (область клеточной мембраны, которая размывается, когда клетка со­вершает движение вперед), та действует на шарик с некоторой силой, при этом наблюдаются его перемещения. Силу, действующую со стороны ламеллипо-дий, измеряют с помощью оптического пинцета. Шарики будут перемещаться до тех пор, пока сила не станет достаточно большой, чтобы разорвать связь между шариком и клеткой. В этот момент произойдет резкое возвращение шарика в центр ловушки. Таким образом можно измерить силу взаимодей­ствия между функционализированным шариком и клеткой. Эта сила оказалась всего лишь около 2 пН. При помещении пептидов, содержащих присоединяю­щую последовательность RGD, в культуральную среду наблюдается уменьше­ние силы. Для выполнения измерений силы взаимодействия между клеткой и шариками необходимо присутствие талина: белка, обнаруженного внутри клет­ки, который считается участником образования фокального контакта, он свя­зывает интегриновые рецепторы с актином внутри клетки.

Клетки отвечают на механические нагрузки. Процесс механотрансдукции, которым клетки отвечают на внешние механические нагрузки путем запуска внутренних биохимических реакций, привлекает постоянно растущий интерес. Механическая нагрузка оказывает глубокое воздействие на сигнальные белки, которые также запускаются от молекул, присоединенных к специфическим ре­цепторам на поверхности клетки. С помощью изменений внеклеточной матрич­ной структуры или при механическом воздействии можно полностью сменить фенотип клетки и вызвать изменение ее формы независимо от факторов роста или интегринового присоединения. Подобные наблюдения стимулировали изыс­кание способов производить направленное воздействие на клетку, а также мето­дов количественных измерений механических характеристик клетки.

Одним из самых лучших способов вызвать механическое нагружение в клет­ках является ограничение их роста при выращивании на поверхностях, поде­ленных на адгезивные области и на области, препятствующие адсорбции бел­ков. Большинство пионерских работ в этой области было проведено группой Уайтсайдса в Гарварде. Для контроля за химической структурой поверхности они использовали самособирающиеся монослои (ССМ) из различных алкантио-лов (HS(CH₂)_/!Z). Эти ССМ легко могут быть нанесены методом микроконтак­тной печати на поверхность золота с помощью эластомерного штампа, по­крытого раствором нужного тиола. После удаления штампа на поверхности отпечатывается нужный рисунок. Лакуны в этом рисунке (непокрытые участ­ки поверхности золота) заполняются путем погружения образца в спиртовой раствор контрастного тиола, который адсорбируется на золотой поверхности. В результате образуется поверхность, состоящая из четко очерченных областей с разным биологическим откликом. Например, первый тиол может иметь оли-гоэтиленгликолевые концевые группы, тогда он препятствует адсорбции белков на поверхности, делая свою область недоступной для клеток. Второй же тиол, напротив, может заканчиваться метальными терминальными группами, на которые легко адсорбируются белки. Задавая области поверхности, занятые метилированными тиолами, можно точно задать места закрепления растущих клеток на поверхности. Постепенно уменьшая площадь адгезивных областей, можно очень сильно ограничивать пространство для роста клеток и тем самым вызывать их апоптоз (процесс запрограммированной гибели клетки).

Существует несколько методов измерения механического отклика клетки. Один из них заключается в использовании подложки с микроиглами, изготов­ленными из полидиметилсилоксана (ПДМС). Для этого сперва одним из ли­тографических методов готовят кремниевую мастер-форму, состоящую из мас­сива столбиков. В ней отливается и отверждается мастер-форма из ПДМС, состоящая из упорядоченного набора узких ям. В этой мастер-форме отлива­ются и отверждаются последующие ПДМС-подложки с массивом эластомер-ных игл. При выращивании клеток на такой подложке, по мере своего роста, они будут оказывать воздействие на эти иглы, в результате чего те изгибаются. Если механические свойства ПДМС известны, нетрудно измерить силы, с ко­торыми растущие клетки действуют на микроиглы.