6.4. Генетическая инженерия с участием других клеток-хозяев

Е. coli— излюбленный объект подавляющего большинства работ по клонированию и генетической инженерии, поскольку этот организм наиболее детально изучен на молекулярном уров­не. В то же время Е. coli практически не известна в микробио­логической промышленности; будучи грамотрицательной бакте­рией, Е. coli содержит в своей наружной оболочке токсичные липополисахариды (заражение крови Е. coli приводит к ле­тальному исходу в 50% случаев) и не секретирует белки в сре­ду. К тому же как прокариота Е. coli не способна осуществлять характерные для эукариотических клеток сплайсинг и посттранс­ляционную модификацию белков. В силу этих и ряда других причин большой интерес представляет разработка систем кло­нирования и экспрессии в других, отличных от Е. coli организ­мах. При этом во всех случаях важно иметь в виду следующие факторы, которые могут препятствовать экспрессии чужеродно­го гена:

1. Разрушение чужеродных ДНК или РНК нуклеазами клетки-хозяина.

2. Несрабатывание механизма репликации вектора.

3. Низкая активность промотора или терминатора транскрип­ции.

4. Неполный сплайсинг мРНК.

5. Неэффективная трансляция.

6. Гидролиз протеазами.

Кроме того, необходима эффективная методика, обеспечиваю­щая введение вектора в клетку-хозяина с высоким выходом.

Известны методы клонирования и экспрессии генов в не­скольких бактериях. Из последних наиболее хорошо изучена, по-видимому, Bacillus subtilis — грамположительный, непато­генный, непаразитический микроорганизм, использовавшийся до начала эры генетической инженерии в микробиологической промышленности для производства ряда ферментов и полипеп­тидных антибиотиков. В. subtilis секретирует некоторые свои белки в среду. В генетической инженерии последнее свойство особенно удобно, поскольку секретируемые белки обычно не за­грязнены большим количеством очень близких внутриклеточных белков. К тому же секреция белка в среду в принципе позволя­ет достичь более высокой концентрации синтезируемого белка по сравнению с внутриклеточными белками. (Каков верхний

В последние годы удалось добиться больших успехов в ге­нетической инженерии эукариотических клеток. Особенно ин­тенсивно изучались дрожжи Saccharotnyces cerevisiae; этот мик­роорганизм выгодно отличается мощной генетической системой, способной к прямой экспрессии как некоторых эукариотических, так и ряда прокариотических генов, а также способностью трансформироваться с помощью чистой ДНК. Дрожжи также осуществляют по меньшей мере некоторые из типичных для эукариот посттрансляционных модификаций и секретируют не­которые белки в среду. Например, рекомбинантные S. cerevi­siae продуцируют антиген австралийского гепатита В, который по степени гликозилирования и агрегации, по-видимому, не от­личается от антигенов, обнаруженных в организме страдающих этим заболеванием людей. Генетически модифицированные дрожжи синтезируют и секретируют в среду иммунный интер­ферон человека (INF-'y).

Клонирование и экспрессия генов в клетках млекопитающих пока что осуществлялись только с помощью векторов на основе вируса SV40. Геном этого вируса (ковалентно замкнутая коль­цевая ДНК) может реплицироваться в клетках млекопитающих как самостоятельно, так и после включения в хромосомы клет­ки-хозяина. Процесс экспрессии клонированного гена обеспечи­вается наличием в вирусе SV40 как промоторов, так и участка начала репликации, функционирующими в клетках млекопита­ющих.

Наиболее удобным для клонирования и идентификации ДНК остается все же быстрорастущий организм Е. coli, к кото­рому применимо большинство методик генетической инженерии. Поэтому, если конечной целью являются многократная репли­кация вектора и экспрессия его генов в другом организме, час­то оказывается удобным прибегнуть к помощи так называемо­го челночного вектора, который может реплицироваться как в Е. coli, так и в другом организме. Очевидно, что челночный век­тор должен обладать двумя участками начала репликации — по одному на каждый организм-хозяин. На рис. 6.6 приведена схема челночного вектора, предназначенного для продуцирова­ния иммунного интерферона .(INF-'y) в клетках обезьян. В этом векторе фрагмент из 342 пар оснований, содержащий участок начала репликации и «поздний» промотор из SV40, связан с фрагментом кДНК, в состав которой входят кодирующая по­следовательность npe-INF-f, а также с фрагментом pBR322, включающим ген устойчивости к ампициллину и участок нача­ла репликации Е. coli. Трансфекция (инфекция клеток чистой вирусной ДНК) трансформированных клеток обезьян линии COS-7 через 3—4 дня привела к INF-f-активности порядка 50—100 единиц в 1 мл культуральной жидкости. Этот пример может служить иллюстрацией тех преимуществ, которыми об­ладают генетически модифицированные клетки-хозяева млеко­питающих ш синтезе белков млекопитающих, когда все стадии 5иосинтеза белков и их секреции должны с максимально дости-симой точностью воспроизводить соответствующие стадии, Осуществляющиеся при синтезе и транспорте этих белков in vivo.

Успешно развиваются также работы по введению чужерод­ных генов в целые организмы растений и животных и их после-

РИС.6.6. Схема челночного вектора для E. coli и клеток обезьяны, осуществляющего экспрессию иммунного интерферона в клетках обезьяны и его секрецию.

дующей экспрессии. Хотя анализ методологии этих работ не входит в тематику настоящей книги, их потенциальная значи­мость для человека очевидна. Открывающие новые перспекти­вы научные и технические достижения в то же время стимули­ровали широкие дискуссии (в том числе и в литературе) о воз­можности неблагоприятного воздействия биотехнологии на об­щество [24].

Заключение

Приведенный в табл. 6.1 перечень основных этапов синтеза белка с помощью рекомбинантных ДНК может служить крат­ким обзором темы настоящего раздела. Запомните, что клони­рование необходимого гена и его экспрессия эффективно вы­полняются как отдельные последовательные операции. Следует еще раз подчеркнуть необходимость постоянного контроля лю­бых превращений ДНК путем определения нуклеотидной последовательности и изучения фрагментов, образующихся при рас­щеплении рестриктазами.

Объем нашей книги позволяет изложить тему этого раздела только в очень сжатой форме. Принимая во внимание ту боль­шую роль, которую будет играть технология рекомбинантных ДНК в будущем, технологу-биохимику необходимо значительно глубже изучить основы молекулярной биологии и соответствую­щей методологии. Знание этих отраслей науки необходимо при знакомстве с современной биологической литературой, а также

Таблица 6.8. Последовательность этапов работы по клонированию гена и экспрессии соответствующего белка методами технологии рекомбинантных ДНК

при разработке в сотрудничестве с молекулярными биологами оптимальных организмов и процессов. Факторы, определяющие продуктивность рекомбинантных популяций (уровни экспрессии гена, активности внутриклеточных протеаз, генетическая ста­бильность и т. п.), зависят от нуклеотидной последовательности вектора, генетических свойств клетки-хозяина, состава среды» конструкции биореактора и условий его работы. Для понимания этих зависимостей, а также различных взаимосвязей в генетиче­ски видоизмененном организме необходимы совместные усилия специалистов в области биохимической технологии и молеку­лярной биологии.

Егорова 132- 157