6.8.Генная инженерия растений

Генно-инженерные методы, в частности технология рекомби-нантных ДНК, позволяют создавать новые генотипы и, следова­тельно, новые формы растений гораздо быстрее, чем классичес­кие методы селекции. Кроме того, появляется возможность целе­направленного изменения генотипа — трансформации — благо­даря введению определенных генов.

Проблемы выращивания сельскохозяйственных растений свя­заны с перспективой ввода в них генов устойчивости к стрессо­вым факторам, фитопатогенам, гербицидам и пестицидам, генов скороспелости, а также с расширением круга культурных расте­ний, способных к симбиотической фиксации азота и т.д.

Генетическая трансформация заключается главным образом в переносе чужеродных или модифицированных генов в эукариотические клетки. Можно вводить гены в клетки прокариот, но этот [ перенос осуществляется не для трансформации, а в целях увеличе-$ ния экспрессии чужеродных генов, их клонирования. В клетках ' растений также возможна экспрессия генов, перенесенных не только | от других растений, но и от микроорганизмов и даже от животных. 1 . Получение растений с новыми свойствами из трансформиро-|, ванных клеток (регенерация) возможно благодаря их свойству то-|: типотентности, т.е. способности развиваться в целое растение. Однако возможности генной инженерии растений ограничи­ваются рядом причин. Во-первых, геном растений изучен хуже, чем геном млекопитающих. Это значит, что определение и выде­ление искомых генов — задача очень трудная. Во-вторых, не для всех растений удается подобрать условия регенерации. Стабильно получают растения-регенеранты из протопластов картофеля, лю­церны, томатов, моркови, табака, капусты и др. Регенерацию зла­ков из их клеток пока не всегда удается воспроизвести. Наконец, одна из главных лимитирующих причин — размер гетерологичной ДНК (не более 35 кб для агробактериальной и немного больше для баллистической трансформации), которую можно было бы эффективно вводить в геном растения. Не так давно была сделана удачная попытка использовать при трансформации пыльцу в ка­честве супервектора, что позволяет исключить появление химер­ных растений (В. А. Аветисов, Ю. В. Давыдова и др., 1999). Имеют­ся сообщения об использовании искусственной бактериальной хро-j мосомы в качестве вектора для трансформации, которая позволя­ет переносить значительные фрагменты ДНК, вводить кассеты ге­нов, кодирующие множественные ступени биохимических про­цессов. Это открывает такие огромные перспективы, что перво­степенными становятся вопросы экологической безопасности.

Биотехнология и, в частности, генная инженерия подошли к той ступени развития, когда прежде всего приходится думать о возможных последствиях эксперимента, об использовании полу­ченных знаний.

6.8.1.Получение трансгенных растений

Перенос генов в растительные клетки, так же как в клетки живот­ных, и их встраивание в геном растений (трансформация) осуще­ствляются главным образом благодаря специфическим структу­рам — векторам.

6.8.1.1.Векторы на основе Ti-плазмид. Некоторые виды агробактерий (Agrobacteria) могут заражать двудольные растения, вызывая об­разование опухолей — корончатых галлов. Одним из самых силь­ных индукторов опухолей служит почвенная бактерия A. tumefaciens. Способность этой бактерии к образованию опухоли связана с боль­шой внехромосомной плазмидой, получившей название Ti-плазмида (от англ. tumor inducing— индуцирующие опухоль). Ti-плаз-миды — это естественные векторы для генов, обладающие всеми функциями, необходимыми для переноса, стабильного включе­ния и экспрессии генетической информации в растениях. Они имеют широкий круг хозяев. В бактериальных клетках Ti-плазми-ды реплицируются автономно. Эти плазмиды различаются по типу кодируемых опинов — белков, которые используются бактерия­ми в качестве источников азота и углерода. Обычно встречаются плазмиды, кодирующие два типа опинов: либо октопин (октопи-новая плазмида), либо нопалин (нопалиновая плазмида).

После заражения часть Ti-плазмиды встречается в хромосомах клеток растения-хозяина. Следовательно, A. tumefaciens встраива­ет часть своего генома в ДНК растительной клетки и заставляет ее таким способом изменять метаболизм, синтезируя вещества, не­обходимые для бактерий. Именно это свойство A. tumefaciens и послужило поводом для создания на основе Ti-плазмиды векто­ра, доставляющего необходимые гены в клетку.

Участок Ti-плазмиды, встречающийся в хромосомах раститель­ных клеток, называется Т-областью в бактерии и Т-ДНК в клет­ках растений. Т-область включает примерно 10 % Ti-плазмиды и содержит гены, отвечающие за индукцию опухоли, синтез опи­нов и подавление дифференцировки (гормоннезависимый рост клеток). Важно отметить, что все гены, ответственные за перенос и интеграцию генов Т-области, находятся не в ней самой, а ря­дом — в области вирулентности — vir-области (рис. 6.13).

Т-области ограничены прямыми повторяющимися последова­тельностями, и любая ДНК, вставленная между этими повтора­ми, будет принята за Т-область и перенесена в растительную клетку.

а вместо ее структурных генов вшивают структурную часть гена, который надо ввести в растение. Такие гены с позиции их регене­рации безвредны для растений.

Существуют и другие бактерии (A. rhizogenes), вызывающие уси­ленное образование корешков при заражении растений. За этот процесс ответственны содержащиеся в них так называемые Ri-плазмиды (от англ. root inducing — индуцирующий корни). Ri-плаз-миды выгодно отличаются от Ti-плазмид тем, что они служат ес­тественными безвредными векторами, так как трансформирован­ные с их помощью растительные клетки сохраняют способность к морфогенезу и к регенерации здоровых растений. В связи с этим Ri-плазмиды в данный момент рассматриваются как более перс­пективные векторы.

6.8.1.2.Промежуточный и бинарный векторы. Эти векторы конструиру­ются на основе Ti-плазмид. Промежуточный вектор получают пу­тем ряда сложных операций. Сначала Т-область с помощью рест-риктаз вырезают из плазмиды, вставляют в вектор для клониро­вания в клетке Е. coli и размножают. Затем внутрь Т-области встра­ивают чужеродный ген и вновь размножают. Полученную реком-бинантную плазмиду вводят в клетки A. tumefaciens, несущие пол­ную Ti-плазмиду. В результате двойного кроссинговера между го­мологичными участками Т-область рекомбинантной плазмиды, со­держащая чужеродный ген, включается в Ti-плазмиду клетки хозя­ина, заместив в ней нормальную Т-область. Наконец, бактериями, имеющими Ti-плазмиду со встроенными генами, заражают рас­тения, где эти гены встраиваются в геном растительной клетки.

Бинарные векторы представляют собой бактерии, содержащие две разные Ti-плазмиды. Одна из них несет vir-область и обеспе­чивает интеграцию в геном растительной клетки Т-области, со­держащей любые гены другой плазмиды. В этом случае двойной кроссинговер не требуется.

Однако полученные в результате заражения бактериями расти­тельные клетки не способны к регенерации, так как у них подав­лена дифференцировка. Трансформированные растительные клетки смогут дифференцироваться, если в гены, блокирующие диффе-ренцировку, ввести мутации или вырезать их из Т-ДНК.

6.8.1.3.Векторы на основе ДНК-содержащих вирусов растений. Виру­сы можно рассматривать как разновидности чужеродной нуклеи­новой кислоты, которые реплицируются и экспрессируются в клет­ках растений. Подавляющее большинство фитовирусов в качестве носителя генетической информации содержат РНК. Только 1 — 2 % вирусов, инфицирующих растения, относятся к ДНК-содержа-щим. Именно эти вирусы удобны для использования в технологии рекомбинантных ДНК, а также в качестве векторов.

ДНК-содержащие вирусы могут включать одноцепочечную или двухцепочечную ДНК. В качестве представителей первой группы можно назвать вирус золотистой мозаики фасоли (ВЗМФ) или вирус полосатости кукурузы. Наиболее изученный представи­тель группы вирусов с двухцепечечной ДНК — вирус мозаики цветной капусты (ВМЦК), поражающий в основном растения семейства крестоцветные.

Обычно фитовирусы реплицируются с образованием большо­го числа копий молекул нуклеиновых кислот — 10⁶ и более моле­кул на зараженную клетку. Например, при репликации вируса та­бачной мозаики образуется 10⁷ молекул нуклеиновых кислот (РНК) на клетку. Поэтому фитовирусы представляют собой очень эффективные средства для получения хорошей экспрессии чуже­родного гена. Кроме высокой копийности вирусной нуклеиновой кислоты вирусные векторные системы имеют еще ряд преиму­ществ: малый размер генома (возможность легкой манипуляции вирусной ДНК) и сильные промоторы, обеспечивающие эффек­тивную экспрессию чужеродных генов.

Однако вирусы в качестве векторов обладают и существенными недостатками: имеют небольшую емкость, патогенны и неспособ­ны встраиваться в хромосомы хозяина. Небольшую емкость мож­но увеличить, если инфицировать вирусом (например, ВМЦК) растительные протопласты, а не клетки. В этом случае инфекция не передается от клетки к клетке, нет необходимости в упаковке ДНК в вирусные частицы.

Следовательно, часть вирусного генома, ответственная за упа­ковку в вирусные частицы, может быть удалена и замещена до­полнительной чужеродной ДНК. Другой недостаток — отсутствие способности встраиваться в геном растительной клетки — удается обойти (по крайней мере для ВМЦК) благодаря специальному методическому приему — агроинфекции. Для этого геном ВМЦК встраивают в Т-область Ti-плазмиды и в ее составе интегрируют в ядерный геном различных растений.

6.8.1.4.Методы прямого переноса генов в растение. Эти методы возник­ли благодаря появлению специфического объекта — изолирован­ных протопластов, т. е. клеток, лишенных целлюлозной стенки.

Методы прямого переноса генов довольно многочисленны:

1. Трансформация растительных протопластов. Осуществляется благодаря комбинации методик кальциевой преципитации ДНК и слияния протопластов. Для трансформации может быть исполь­зован практически любой ДНК-вектор. Донорная ДНК может не содержать специальных биологических сигналов (vir-областей, по­граничных областей Т-ДНК).

2. Культуру протопластов на начальной стадии ее роста заража­ют агробактериями, которые используют в качестве векторов.

3. Микроинъекции ДНК. Аналогичен методу микроинъекций животных клеток. Этот метод можно рассматривать как наиболее универсальный. Эффективность трансформации растительных клеток — 10 — 20% независимо от типа вектора. Трансформация не видоспецифична, возможен перенос генов в любое растение.

4. Электропорация. Метод основан на повышении проницаемо­сти биомембран за счет действия импульсов высокого напряже­ния. В результате молекулы ДНК проникают в клетки через поры в клеточной мембране.

5. Упаковка в липосомы. Это один из методов, позволяющих защитить экзогенный генетический материал от разрушения нук-леазами растительной клетки. Липосомы — сферические тельца, оболочки которых образованы фосфолипидами.

6.8.1.5.Метод биологической баллистики. Это один из самых эффектив­ных методов трансформации однодольных растений. Исходный мате­риал для трансформации — суспензионная культура, каллусная ткань или 4—5-дневные культивируемые незрелые зародыши однодольных.

Метод основан на напылении ДНК-вектора на мельчайшие ча­стички вольфрама, которыми затем бомбардируют клетки. Бом­бардировка осуществляется с помощью биолистической пушки за счет перепада давления. Часть клеток гибнет, а выжившие клетки трансформируются, затем их культивируют и используют для ре­генерации растений.