Оценка симптомов ирритативного действия пкп

Симптомы раздражения	Выраженность симптомов раздражения	Оценка в баллах
Гиперемия конъюнктивы и слизистой век	Отсутствие видимого раздражения, четкий сосудистый рисунок	0
	Сосуды инъецированы (расширены)	1
	Отдельные сосуды трудно различимы, легкое покраснение слизистой	2
Отек век	Отсутствие видимых изменений	0
	Слабый отек (набухшие веки)	1
	Выраженный отек (частичное выворачивание век)	2
Выделения из глаза	Отсутствие выделений	0
	Минимальное количество в углу глаза	1
	Выделения увлажняют веки	2

Индекс ирритативного действия испытуемой ПКП на слизистую оболочку глаз в баллах вычисляют по формуле:

где R — выраженность гиперемии реакции в баллах; Т — выраженность отека в баллах; В — выраженность выделений в баллах; о — результаты суммарной оценки состояния слизистой опытного глаза; k — результаты суммарной оценки состояния слизистой контрольного глаза; 1, 2, …, n — порядковый номер животного; n — количество животных в группе.

Пример расчета.

Спустя 24 часа после инсцилляции 50 мг крема для век «Х» в правый глаз кроликов у всех 3 животных, отобранных для эксперимента, наблюдали инъецированность сосудов, набухание век, отсутствие выделений. У одного из животных в левом глазу, куда инсциллировали 50 мкл дистиллированной воды, отмечено минимальное количество выделений в углу глаза. Рассчитать индекс ирритативного действия.

Решение. Для расчета индекса ирритативного действия необходимо оценить симптомы ирритативного действия крема для век «Х» в баллах: для опытного глаза: выраженность гиперемии (инъецированность сосудов) — по 1 баллу для каждого животного, выраженность отека (набухание век) — по 1 баллу для каждого животного, выраженность выделений — 0 баллов; для контрольного глаза: выраженность гиперемии и выраженность отека — 0 баллов для каждого животного, выраженность выделений — 1 балл для одного животного. Индекс ирритативного действия равен:

Ответ: индекс ирритативного действия крема для век «Х» равен 1,67 балла, что не соответствует требованиям СанПиН № 10-33-95 и СанПиН № 10-33.1-95.

Испытуемый образец ПКП не раздражает слизистые, если индекс ирритативного действия на слизистую оболочку глаз равен 0 баллов.

Индекс острой пероральной токсичности

По проявлениям гибели лабораторных животных и (или) симптомов интоксикации при однократном внутрижелудочном (пероральном) введении определенной дозы испытуемых образцов ПКП судят о наличии у них острого токсического и раздражающего слизистые оболочки желудочно-кишечного тракта действия. В качестве лабораторных животных используют здоровых белых крыс массой 180–220 г.

За сутки до начала эксперимента формируют опытную и контрольную группы животных из числа визуально здоровых особей, не отличающихся между собой по массе более чем на 10 %.

Из испытуемого косметического образца твердой и пастообразной консистенции готовят 50 %-ные водные суспензии или эмульсии, эликсиры и жидкости для полоскания рта вводят в нативном виде, а из спиртосодержащих средств готовят двойные объемные разведения (1:1). В качестве растворителя используют дистиллированную воду.

Приготовленный к испытанию косметический образец шприцем с иглой-зондом по общепринятой в токсикологии методике вводят животным опытной группы внутрижелудочно натощак определенный объем раствора, содержащего стандартную дозу нативного образца из расчета 10 г на 1 кг веса каждого животного. Контрольным крысам аналогично и в том же объеме вводят дистиллированную воду. Кормление животных допускается не ранее, чем через 3 ч после введения.

Наблюдение за состоянием лабораторных животных проводят ежедневно утром в течение 5 суток. Визуально контролируют и регистрируют количество и сроки гибели животных, клинические симптомы интоксикации (изменение поведения, внешнего вида, пище- и водопотребления, реакций на внешние раздражители, частоты дыхания, окраски ушей и конечностей, наличие мимических подергиваний и тремора конечностей, развития наркотического и коматозного состояния и др.) и раздражения слизистых оболочек желудочно-кишечного тракта (срыгивание, слюнотечение, изменение характера испражнений и др.).

При выявлении гибели животных и (или) установлении клинических симптомов интоксикации проводят вскрытие животных и макропатоморфологические исследования внутренних органов, слизистой оболочки рта и желудочно-кишечного тракта с определением их состояния (наличие гиперемии, геморрагии, отечности, эрозий и др.) в сравнении с животными контрольной группы.

Острая пероральная токсичность у испытуемого образца косметической продукции и индекс острой пероральной токсичности равен нулю (I_t.ac.o.= 0 баллов) при отсутствии гибели опытных крыс, клинических симптомов интоксикации и раздражения слизистой желудочно-кишечного тракта, связанных с воздействием вводимого внутрижелудочно образца, в сравнении с контрольными животными.

Испытуемый образец является токсичным при поступлении внутрь организма и опасным для здоровья, а индекс острой пероральной токсичности равен 1,0 (I_t.ac.o.= 1 балл) при установлении причинной зависимости гибели и (или) симптоматики интоксикации опытных животных от введения испытуемого образца продукта в сравнении с контрольными белыми крысами.

Выявление сенсибилизирующей способности

Содержащиеся в ПКП высокомолекулярные соединения при контакте с кожей и слизистыми обычно не представляют реальной аллергоопасности. Однако многие низкомолекулярные соединения и ингредиенты в косметических средствах (особенно красители, отдушки, стабилизаторы, консерванты) способны к трансдермальному проникновению и образованию (за счет активных химических детерминант) конъюгатов с аутобелками организма, что может индуцировать гиперчувствительность замедленного и (или) немедленного типов к этим веществам и содержащим их ПКП. Поэтому исследования сенсибилизирующей способности являются обязательным этапом определения гигиенической безопасности ПКП и прогнозирования аллергоопасности ПКП при контакте с кожными покровами. Применимы два метода испытаний — по вариантам А и Б.

Индекс сенсибилизирующей способности по варианту А

Вариант А — экспериментальный, выполняют на морских свинках при многократных эпикутанных аппликациях испытуемого образца ПКП на фоне неспецифической иммуностимуляции организма. Данный вариант испытания позволяет в одном эксперименте адекватно оценить раздражающее действие на кожу и определить контактную сенсибилизирующую способность ПКП, в т. ч. окрашивающих кожу.

Эпикутанные сенсибилизирующие аппликации испытуемым образцом ПКП проводят многократно в течение 5 дней на опытной группе из не менее чем 8 морских свинок, животным контрольной группы аналогично наносят дистиллированную воду. Условия и требования к подготовке и проведению испытаний, оценке результатов раздражающего действия такие же, как при установлении индекса кожно-раздражающего действия.

За сутки до первой аппликации в апоневроз всех четырех лап животных опытной и контрольной групп после обработки места инъекции этиловым спиртом вводят 0,01 см³ полного адъюванта Фрейнда.

Через 24 ч после последней аппликации испытуемым образцом ПКП определяют его сенсибилизирующую способность провокационным тестом опухания уха (ТОУ). Животным обеих групп испытуемые образцы ПКП в дозе по 0,025 см³ жидких, 0,05 см³ 50 %-ных водных растворов и суспензий твердой консистенции или 0,025 г вязких продуктов равномерно наносят на внутреннюю и наружную поверхности кожи площадью 1 см² срединного сегмента расправленного и фиксированного пальцами рук уха.

Степень опухания определяют по разнице толщины уха, измеряемой микрометром до и через 24 ч после тестирования у каждого животного обеих групп. Показатели ТОУ вычисляют сначала для каждого животного в отдельности по разнице в толщине уха до и через 24 ч после тестирования (Х_k1, Х_{k 2}, …, Х_{k n}, Х_{о 1}, Х_{о 2}, …, Х_{о n}), затем — среднегрупповые (для опытной и контрольной групп) по формуле:

или ,

где Х_k или Х_о — среднегрупповые показатели ТОУ (в мм) в контрольной или опытной группах животных; k или о — контрольная или опытная группы животных; Т₂₄ — толщина уха в мм через 24 ч после тестирования; Т_ф — толщина уха в мм до тестирования (фоновая); 1, 2, …, n — порядковый номер животного в каждой группе; n — количество животных в каждой группе.

За результат испытания принимают статистическую достоверность различий показателей ТОУ опытной и контрольной групп по критерию Стьюдента. Сенсибилизирующая способность у испытуемого образца отсутствует (I_s. = 0 баллов) при статистически недостоверных различиях показателей ТОУ в опыте и контроле, а рассчитанная величина нормированного отклонения t меньше значения коэффициента Стьюдента, соответствующего уровню доверительной вероятности при р = 0,95 (приложение).

Нормированное отклонение t рассчитывается по формуле:

,

где Х_k или Х_о — среднегрупповые показатели ТОУ (в мм) в контрольной или опытной группах животных; S_{Xo — Xk} — средняя ошибка разницы между средними среднегрупповыми показателями ТОУ контрольной и опытной групп животных.

Среднюю ошибку разницы при сравнении двух групп с малым числом результатов наблюдений (n) определяют по формуле:

,

где: числитель — объединенная сумма квадратов отклонений отдельных значений результатов измерений от среднегрупповых показателей ТОУ соответствующей опытной или контрольной группы; знаменатель — сумма чисел степеней свободы обеих сравниваемых групп; n_o и n_k — количество животных в опытной и контрольной группах животных.

Испытуемый образец ПКП обладает сенсибилизирующей способностью разной степени интенсивности (слабой, умеренной или выраженной), а индекс сенсибилизирующей способности по варианту А оценивают равным соответственно 1, 2, 3 (I_s. = 1 балл, I_s. = 2 балла, I_s. = 3 балла соответственно) при статистически достоверном превышении показателя ТОУ в опыте над таковым в контроле — рассчитанная величина равна или больше значения коэффициента Стьюдента, соответствующего уровню доверительной вероятности р = 0,95; р = 0,99; р = 0,999 соответственно.

Пример расчета.

При постановке исследований по выявлению возможных сенсибилизирующих свойств (по варианту А) у краски для волос «Х» на двух группах животных, состоящих из 8 морских свинок, были получены следующие результаты теста опухания уха (табл. 7):

Таблица 7

Порядковый номер животного	Контрольная группа		Опытная группа
	толщина уха до тестирования (Тф), 10-3 мм	толщина уха после тестирования (Т24), 10-3 мм	толщина уха до тестирования (Тф), 10-3 мм	толщина уха после тестирования (Т24), 10-3 мм
1	45	47	51	59
2	43	47	57	65
3	47	48	49	62
4	51	54	52	67
5	48	55	56	68
6	45	55	54	60
7	50	61	59	65
8	52	57	48	51

Рассчитать индекс сенсибилизирующей способности по варианту А.

Решение. Для расчета индекса сенсибилизирующей способности необходимо рассчитать показатель ТОУ (разницу в толщине уха до и через 24 ч после тестирования) для каждого животного (Х_i) и среднегрупповые (для опытной (Х_о) и контрольной (Х_k) групп), среднюю ошибку разницы обеих подопытных групп S_{Xo — Xk} и нормирование отклонение t (табл. 8).

Таблица 8

n	Контрольная группа, 10–3 мм					Опытная группа, 10–3 мм
	Тф	Т24	Т24–Тф	Xi–Xk	(Xi–Xk)2	Тф	Т24	Т24–Тф	Xi-Xo	(Xi–Xo)2
1	45	47	2	–3,38	11,424	51	59	8	–0,88	0,774
2	43	47	4	–1,38	1,904	57	65	8	–0,88	0,774
3	47	48	1	–4,38	19,184	49	62	13	+4,12	16,974
4	51	54	3	–2,38	5,664	52	67	15	+6,12	37,454
5	48	55	7	+1,62	2,624	56	68	12	+3,12	9,734
6	45	55	10	+4,62	21,344	54	60	6	–2,88	8,294
7	50	61	11	+5,62	31,584	59	65	6	–2,88	8,294
8	52	57	5	–0,38	0,144	48	51	3	–5,88	34,574
	Среднегрупповой показатель Хk = 5,38				∑ = 93,87	Среднегрупповой показатель Хo = 8,88				∑ = 26,76

.

.

.

.

Сравнивается полученное значение нормированного отклонения t (2,38) со значениями коэффициента t, согласно приложению, при степенях свободы n = 15 (8 + 8 – 1) при р = 0,95 (2,13) и р = 0,99 (2,95): 2,13 < 2,38 > 2,95. Следовательно, индекс сенсибилизирующей способности краски для волос «Х» по варианту А равен 1 балл, что противоречит требованиям СанПиН № 10-33-95 и СанПиН № 10-33.1-95.

Индекс сенсибилизирующей способности по варианту Б

Метод выявления сенсибилизирующей способности ПКП по варианту Б — клинико-аллергологический, его выполняют постановкой аллергологических проб на привлекаемых волонтерах-добровольцах (не менее 8 человек). Испытания проводят постановкой закрытой эпикутанной «лоскутной» пробы, которая включает первичную сенсибилизирующую и вторичную провокационную аппликации.

Исследования начинают с подготовки 4-слойных марлевых тампонов размером 1  1 см, накладок из полиэтиленовой пленки размером 2  2 см. Затем готовят дозы испытуемых ПКП: вязкой консистенции — по 0,05 г; твердой консистенции — 0,05 г разводят дистиллированной водой в 2 раза до получения 50 %-ных растворов, эмульсий, суспензий; из спиртосодержащих продуктов готовят двукратные (1:1), а из моющих средств — десятикратные (1:9) водные разведения. Приготовленные растворы или жидкие ПКП наносят в дозе по 0,05 см³ на марлевые тампоны, размещенные на полиэтиленовых накладках.

Первичную аппликационную пробу выполняют наложением на кожу внутренней поверхности предплечья или плеча волонтера после обработки места аппликации 20 %-ным этиловым спиртом марлевого тампона с дозой испытуемого вещества так, чтобы полиэтиленовой подкладкой полностью прикрыть тампон, а саму подкладку фиксируют полосками лейкопластыря или бинтованием. Контрольную пробу с дистиллированной водой выполняют аналогично опытной на участке кожи, отстоящем от опытного участка на 1 см.

Через сутки первичную аппликацию снимают, смывают остатки вещества с кожи опытного и контрольного участков струей теплой водой с туалетным мылом или ватным тампоном с 20 %-ным этиловым спиртом и спустя 1 час регистрируют функциональное состояние кожи на месте аппликации (по эритематозной реакции).

При возникновении у волонтера в период аппликационной экспозиции негативных клинических симптомов раздражения (ощущение зуда, жжения, болезненности) даже слабой (переносимой) интенсивности со стороны опытного участка кожи, пробу немедленно снимают. В этом случае, а также при определении на опытном участке кожи эритемы после первичной аппликации (при отсутствии таковой на контрольном), эту аппликацию у данного волонтера повторяют на другом участке кожи, снизив концентрацию испытуемого продукта в 2 раза. В случае появления в процессе и после завершения повторной первичной аппликации субъективных симптомов раздражения у данного волонтера, его исключают из дальнейших исследований.

При регистрации негативных проявлений у двух и более лиц дальнейшие исследования не проводят и делают вывод о том, что данный образец обладает кожно-раздражающим действием (I_cut. = 1 балл).

В случае отсутствия субъективных симптомов и объективных признаков раздражения после первичной аппликации аналогично, рядом с предыдущей (на расстоянии не менее 2 см), проводят вторичную 24-часовую аппликацию с тем же образцом, а также контрольную пробу с дистиллированной водой (на месте первичной «контрольной» пробы).

При возникновении хотя бы у одного добровольца в период проведения вторичной аппликации клинических симптомов (зуд, жжение, болезненность), опыт с испытуемым образцом прекращают и делают вывод о наличии у него сенсибилизирующих свойств, и I_s. принимают равным 1 баллу.

Через 1 ч (после обработки), 24 и 48 ч после суточной вторичной аппликации одновременно на участках первичной и вторичной аппликаций испытуемого изделия и контрольной пробы визуально в соответствии с таблицей 9 регистрируют функциональное состояние кожных покровов (интенсивность эритематозной реакции, наличие первичных высыпаний), а также учитывают субъективные клинические симптомы (зуд, жжение, болезненность, их выраженность).

Таблица 9