Ферментные спектры при гепатите и механической желтухе

Диагностическая ценность исследования ферментов существенно повысилась после внедрения в клиническую практику методов определения изоферментов. В последние годы клиническая лабораторная практика всё чаще прибегает к изучению изоферментных спектров крови. Изоферменты – разновидности одного и того же фермента могут отличаться набором полипептидных цепей в молекуле фермента, а также субклеточной локализацией в отдельных органеллах, специфичностью к различным активаторам и ингибиторам. Изоферментам свойственна выраженная органоспецифичность. Так, для миокарда наиболее характерны изоферменты ЛДГ₁ , МВ-креатинкиназа, для печени – ЛДГ_5. Изоферменты лейцинаминопептидазы (ЛАП) распределены в различных органах следующим образом: ЛАП₁ в жёлчных путях, ЛАП₂ – в поджелудочной железе, ЛАП₃ – в почках, ЛАП ₄ – в тонком кишечнике.

При проведении энзимодиагностики необходимо учитывать динамику активности фермента при определённых заболеваниях. Исследование активности ферментов целесообразно проводить в те сроки от начала заболевания, когда их активность наиболее высока. Из приведенного ниже рисунка 9 видно, что при инфаркте миокарда активность АсАТ, МВ-КК повышается уже через 8 часов от начала болевого приступа, достигая наибольших величин в течение первых суток, а затем снижается. Активность ЛДГ начинает обычно повышаться через 12-32 часа, достигая наибольших значений в течение 8-14 дней.

Рисунок 9

Динамика активности ферментов при инфаркте миокарда

АсАТ

ЛДГ

_ _____________________________________________

1 2 3 4 5 6 7 8 дни заболевания

АсАТ – аспартатаминотрансфераза, ЛДГ- лактатдегидрогеназа

При незначительных сдвигах активности отдельных ферментов надёжность энзимодиагностики может быть повышена путём вычисления коэффициентов отношения активности двух ферментов. Например, у здоровых людей коэффициент АсАТ/АлАТ равен 1,33, коэффициент КК/АсАТ равен 2,8, коэффициент ЛДГ₁/ЛДГ₅ равен 0,14 – 0,26. При поражении миокарда приведенные коэффициенты увеличиваются. При заболеваниях печени отношение АсАТ/АлАТ, ЛДГ₁/ЛДГ₅ уменьшается.

При проведении энзимодиагностики у детей первых лет жизни необходимо учитывать возрастные особенности активности некоторых ферментов крови. Единой возрастной закономерности отклонений ферментативной активности у детей нет. Активность ряда ферментов в крови у детей выше, чем у взрослых. Это может быть обусловлено выраженностью анаэробных путей обмена глюкозы в тканях, что проявляется в более высокой активности фермента лактатдегидрогеназы, особенно её изофермента ЛДГ₃. Повышенная активность фермента глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы связана с высокой скоростью протекания пентозо-фосфатного пути окисления глюкозы в тканях, включая эритроциты, с более высокой скоростью разрушения эритроцитов в детском возрасте. Интенсивные обменные процессы в костной ткани в детском возрасте проявляются повышенной активностью в крови фермента щелочной фосфатазы. Повышенная сосудисто-тканевая проницаемость сопровождается некоторым повышением активности трансаминаз в крови детей. В то же время, у детей выявляется более низкая активность ферментов мочевинообразования в силу относительной незрелости гепатоцитов в первые месяцы после рождения. В детском возрасте снижена также активность многих протеолитических ферментов желудка и кишечника – пепсина, трипсина.

В лабораторной медицинской практике достаточно широко используются ферменты в качестве реагентов для количественного определения концентрации некоторых химических компонентов крови. Примером может служить высокоспецифичный глюкозооксидазный метод определения содержания глюкозы в крови. В этом методе под действием флавиновой глюкозооксидазы производят окисление глюкозы с восстановлением ФАД. Образовавшийся ФАДН₂ с кислородом образует пероксид водорода. Пероксид водорода в присутствии фермента пероксидазы окисляет бесцветный о-толидин с образованием окисленного о-толидина синего цвета. По интенсивности развившейся окраски определяют концентрацию глюкозы.

Ферментативные кинетические методы предполагают проведение нескольких последовательных ферментативных реакций, ведущих к восстановлению НАД (НАДФ), обладающих в восстановленной форме способностью поглощать лучи длиной волны 340 нм (оптический тест). Примером такого метода может служить оптический метод определения активности креатинфосфокиназы в следующей цепи реакций:

креатинфосфокиназа

1 ) Креатинфосфат + АДФ креатин + АТФ

гексокиназа

2 ) АТФ + глюкоза АДФ + глюкозо-6-фосфат

Глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа

3 ) Глюкозо-6-фосфат + НАДФ 6-фосфоглюконолактон + НАДФН

Концентрацию НАДФН, которая отражает активность креатинфосфокиназы, определяют спектрофотометрически по приросту оптической плотности при 340 нм.

В диагностических целях при ряде заболеваний исследуют активность ферментов и изоферментов мочи. В моче может выявляться несколько десятков ферментов. Они относятся к классам оксидоредуктаз, трансфераз, гидролаз, лиаз. Источниками ферментов мочи в физиологических условиях служат плазма крови, клетки канальцевого эпителия почек, эпителий мочевыводящих путей и предстательной железы. В патологических условиях в моче появляются ферменты лейкоцитов, эритроцитов, бактериальных клеток. Содержание ферментов в моче обусловлено их молекулярной массой, селективностью реабсорбции и локализацией их в почках. В физиологических условиях в мочу фильтруются ферменты с массой менее 70 кД (амилаза, пепсиноген, липаза). Концентрация этих ферментов моче резко возрастает при заболеваниях желудка, поджелудочной железы. При увеличении проницаемости возможна фильтрация ферментов с более высокой молекулярной массой. Полной реабсорбции в почках подвергаются ферменты лизоцим (17 кД), урокиназа (53 кД). В разных отделах почек локализованы различные ферменты. Клубочки содержат креатинфосфокиназу, корковое вещество – ЛДГ₁, проксимальные канальцы –N-ацетил-Д-глюкозаминидазу (НАГ), гамма-глютамилтрансферазу (ГГТ). Изменение активности данных ферментов наблюдается при поражении почек и позволяет проводить топическую диагностику поражения нефрона. Диагностичекую ценность для диагностики нефроурологической патологии представляет определение в моче активности холинэстеразы, щелочной фосфатазы, арилсульфатазы, β – глюкуронидазы. Имеются данные о целесообразности исследования ферментурии у новорожденных детей для дифференциальной диагностики пиелонефрита и инфекции мочевыводящих путей, а также острой почечной недостаточности и острого интерстициального нефрита.

Перспективным направлением неинвазивного исследования ферментов является определение их активности в слюне. Накапливаются данные о их диагностической ценности при различных заболеваниях. Например, у здоровых людей в слюне не определяется щелочная фосфатаза, а при заболеваниях брюшной полости (холецистите, перитоните, аппендиците) выявляется её высокая активность.

Э н з и м о т е р а п и я – раздел клинической ферментологии, включающий исследования по применению ферментов, коферментов, активаторов, ингибиторов ферментов в качестве лекарственных средств (таблица 6).

Энзимотерапия является патогенетически обоснованной, высокоэффективной, перспективной формой лечения многих заболеваний. Однако, при назначении ферментов врач должен с максимальной точностью взвешивать показания и противопоказания. Необходимо учитывать белковую природу ферментов, их возможную антигенность при многократном применении, нестойкость по отношению к действию пищеварительных и тканевых протеаз, проблемы с проникновением ферментов через гематоэнцефалический барьер.

С целью уменьшения указанных недостатков ферментных препаратов, а также для усиления направленности их действия проводятся исследования по разработке перспективных форм ферментных препаратов. К современным ферментным препаратам относятся, прежде всего, иммобилизованные ферменты, связанные с коллагеновыми пластинками, с различными гелями, декстранами, целлюлозой, полиэтиленгликолем. Постепенное рассасывание основы иммобилизованного фермента сопровождается продолжительным освобождением его в ткани, оказывает местный терапевтический эффект.

К современным формам ферментных препаратов относятся инкапсулированные ферменты, которые заключены в «контейнеры» из полимочевины, нейлона. В подобную форму фермента иногда включают антитела, фибронектин, которые служат вектором и повышают направленность его терапевтического действия. Для повышения устойчивости ферментов к действию протеаз используют различные приёмы их химической модификации: гликозилирование, сукцинилирование.

При заболеваниях органов пищеварения используются ферменты желудочно-кишечного тракта с заместительной целью. При заболеваниях желудка, сопровождающихся пониженной продукцией пепсина, больным назначают пепсин, пепсин с соляной кислотой (пепсидил, абомин, ацидинпепсин). При нарушении функции поджелудочной железы используются препараты, содержащие комплекс панкреатических ферментов: амилазы, липазы, протеаз (например, мезим – форте, панкурмен, трифермент креон, вобэнзим). Препараты ферментов кишечника, поджелудочной железы обычно покрываются оболочкой, помещаются в капсулы для защиты от протеолитического действия желудочного сока. Препараты, предназначенные для заместительной терапии, должны обладать такими свойствами как: высокая специфическая активность, устойчивость оболочки препарата к желудочному соку, быстрая эвакуация из желудка и смешивание с содержимым тонкого кишечника, быстрое растворение оболочки препарата и высвобождение активных ферментов в тонком кишечнике. В случаях заболеваний слизистой тонкого кишечника применяются наборы ферментов желудка, поджелудочной железы с добавлением желчи (например, фестал, панзинорм-форте). Более эффективны препараты, содержащие коньюгированные жёлчные кислоты (соединённые с глицином или таурином).

Таблица 6