8.3. Приготовление мазка из осадка необработанного нативного материала

Мазки из осадка необработанного нативного материла приготавливают из полученного после центрифугирования осадка любого жидкого диагностического материала (бронхоальвеолярные смывы, промывные воды бронхов или желудка, моча, экссудаты и др.). Осадок представляет собой обогащенную фракцию диагностического материла и значительно чаще позволяет получить положительные результаты. Так как особенностью нахождения M.tuberculosis в жидкостях является способность их долгое время находиться во взвешенном состоянии, центрифугирование рекомендуется производить при 3000g.

Для приготовления мазка, надосадочную жидкость аккуратно сливают, полученный в пробирке осадок перемешивают и с помощью пипетки наносят на стекло 1-2 капли осадка, распределяя его тонким слоем в центре стекла на площади не менее 1см х 2см.

Необходимо иметь в виду, что мазки из осадка жидкого материала легко смываются в процессе окраски. Поэтому мазки желательно приготавливать на стеклах, предварительно обработанных яичным белком.

Белок куриного яйца в течение 30-40 минут взбивают с чистыми стерильными стеклянными бусами в стерильной посуде и оставляют на 1-1,5 часа при комнатной температуре. Жидкую часть взбитой смеси отбирают пипеткой, переносят её в другую посуду и, смачивая в ней ватный тампон, аккуратно наносят на чистые обезжиренные предметные стекла, равномерно распределяя по 2/3 их поверхности. Обработанные белком стекла высушивают при комнатной температуре. Стекла готовят накануне их использования. Срок хранения не превышает 2-х суток.

Для закрепления осадка жидкого материала можно использовать сыворотку крови, на чистом стекле каплю сыворотки смешивают с 1-2 каплями осадка материала и распределяют смесь по стеклу.

Не рекомендуется готовить мазки способом “растяжки” материала между двух предметных стекол. Такой способ сопровождается образованием биологически опасного аэрозоля.

8.4. Фиксация мазков

Приготовленные мазки высушивают при комнатной температуре в течение 15-30 минут на мостике для сушки и окрашивания мазков или на лотках, выстланных фильтровальной бумагой, в вытяжном шкафу. Не допускается фиксация сырых мазков над пламенем горелки. Лаборант должен планировать свой рабочий день таким образом, чтоб закончить приготовление, фиксацию, окраску и просмотр препаратов к концу дня. Если исследование не удается закончить, предметные стекла с мазками оставляют на ночь в закрытой коробке, чтобы предотвратить возможность повреждения их и распыления заразного материла, а также исключить доступ к ним насекомых и грызунов. Нефиксированные мазки ни в коем случае не должны оставаться открытыми на ночь. При окраске по Ziehl–Neelsen стекла с высохшими мазками фиксируются трехкратным проведением их в течении 3-5 секунд через верхнюю треть пламени спиртовки до исчезновения признаков запотевания стекла. Для фиксирования можно поместить мазки на электронагреватель для сушки предметных стекол при температуре 65-75°С на 2 часа. Когда все мазки будут зафиксированы, следует обработать пламенем пустой мостик.

Безопасным для персонала является метод фиксации мазков, используемый как при окраске по Ziehl–Neelsen так и люминесцентными красителями, предложенный A.Hain. Согласно этому методу предметные стекла с мазками раскладывают на жестяные или эмалированные подносы и помещают в сушильный шкаф, где сначала высушивают при 37°С. Затем температуру повышают до 105°С и спустя 10 минут шкаф выключают. При таком методе достигается надежное прикрепление материала к стеклу и гибель микобактерий, как находящихся в материале мазка, так и случайно попавших на поднос. Фиксирующая температура не должна превышать 105°С, чтобы не изменить тинкториальные свойства микобактерий.

Фильтровальная бумага, которой был выстлан лоток, по окончании фиксации каждой серии мазков подлежит обязательному сжиганию или автоклавированию, а лоток обжигается спиртом. Лотки ежедневно выстилаются чистой бумагой.

Необходимо ежедневно готовить контрольные достоверно положительные и достоверно отрицательные мазки для контроля качества красителей и методики окрашивания и включать их в число исследуемых мазков, особенно если за 1 день просматривается менее 10 мазков. Отрицательный контроль необходим для того, чтобы убедиться, что растворы красителей не контаминированы КУМ. Допускается приготовление мазков из осадка после обработки мокроты 10% трехзамещенным фосфорнокислым натрием в течение 24 часов с последующим центрифугированием в течение 20 минут при 3000g. Высушенные и фиксированные мазки должны сразу же окрашиваться.