- •Утверждено
- •II. Показания к применению метода
- •III. Возможности метода микроскопического исследования при выявлении кислотоустойчивых микобактерий
- •IV.Сбор диагностического материала
- •V. Организация рабочего места и оборудование, необходимое для микроскопических исследований
- •VI. Транспортировка диагностического материала
- •VII. Правила работы с диагностическим материалом
- •7.1 Прием диагностического материала
- •VIII. Приготовление мазков для микроскопических исследований
- •8.1. Подготовка предметных стекол
- •8.2. Приготовление мазков из нативного материала
- •8.3. Приготовление мазка из осадка необработанного нативного материала
- •8.4. Фиксация мазков
- •IX.Методы окраски диагностических препаратов
- •9.1. Окраска препаратов для световой микроскопии по методу Ziehl–Neelsen
- •9.2. Оборудование и реактивы для окраски по методу Ziehl–Neelsen
- •Процедура окраски.
- •X.Техника микроскопического исследования препарата
- •XI. Учет и интерпретация результатов микроскопического исследования
- •XII. Регистрация результатов исследования
- •XIII. Метод люминесцентной микроскопии
- •13.1. Метод окраски аурамином оо и родамином с
- •13.2. Метод окраски аурамином о
- •XIV. Причины возможных ошибок при выполнении микроскопических исследований
- •14.1. Ложноположительные результаты могут быть обусловлены следующими причинами:
- •14.2. Ложноотрицательные результаты могут быть обусловлены следующими причинами:
- •Возможные причины неисправностей при проведении микроскопии и способы их устранения
- •XV. Контроль и обеспечение качества микроскопического выявления кислотоустойчивых микобактерий
- •XVI. Меры безопасности при работе с инфекционным материалом
- •Правила сбора мокроты.
- •Направление на бактериоскопическое исследование
- •Лабораторный журнал регистрации результатов бактериоскопических исследований
- •Перечень лабораторного оборудования, расходных материалов, реактивов и инструментария для бактериоскопических исследований.
- •Результаты бактериоскопического исследования
- •Форма для оценки работы лаборатории при внешнем контроле качества
- •Расчет числа ложноположительных и ложноотрицательных результатов.
X.Техника микроскопического исследования препарата
Для исследования окрашенных по методу Ziehl–Neelsen мазков наиболее подходит бинокулярный микроскоп с масляным иммерсионным объективом 90Х или 100Х и окуляром 7Х или 10Х. Необходимо просмотреть в определенном порядке весь мазок. Просматривать препараты начинают с левого верхнего, выбранного в мазке, поля зрения, постепенно передвигаясь либо вдоль продольной от препарата линии до конца мазка, либо смещаясь вниз, а затем вновь поднимаясь вверх. Подходящими считают поля зрения, в которых видны клеточные элементы бронхиального происхождения (клетки эпителия, лейкоциты, слизистые тяжи). Поля зрения, не содержащие таких элементов, не учитываются. Количество полей зрения за один продольный проход соответствует как минимум 100-120. В случае, когда результат такого исследования оказывается отрицательным, для подтверждения рекомендуется просмотреть дополнительно еще 200 полей зрения. Таким образом, изучается 300 полей зрения. При значительном количестве кислотоустойчивых микобактерий достаточно исследовать 20-50 полей зрения.
При микроскопическом исследовании препарата рекомендуется просмотреть препарат всегда по одной и той же схеме:
- либо 3 параллельных прохода по длине препарата;
- либо 9 параллельных проходов по ширине.
Суммарное время, затрачиваемое на микроскопическое исследование одного мазка (регистрация, приготовление, окраска, микроскопия), составляет 25-30 минут. На микроскопию одного препарата в среднем затрачивается 10-13 минут. Во избежание загрязнения иммерсионного масла и получения ложноположительного результата нельзя прикасаться пипеткой капельницы масла к мазку, капля масла должна свободно упасть на стекло.
По окончании микроскопического исследования каждого препарата для удаления иммерсионного масла необходимо поместить мазок в вытяжной шкаф, накрыть препарат полоской фильтровальной бумаги и смочить ее несколькими каплями ксилола или толуола. Через 2-3 минуты фильтровальную бумагу удалить. Можно удалить с препарата иммерсионное масло с помощью спирта или спиртоэфирной смесью. Очищенный от иммерсионного масла препарат хранить в коробке для просмотренных положительных или отрицательных препаратов. После просмотра каждого препарата следует тщательно протирать объектив микроскопа от иммерсионного масла марлевыми салфетками, смоченными в 70°-ном, а затем в 96°-ном спирте, либо спиртоэфирной смесью, чтобы предотвратить контаминацию следующего мазка. Марлевые салфетки затем опускают в бак для отходов.
Кислотоустойчивые микобактерии (КУМ) – тонкие малиново-красные палочки длиной 1-10 (чаще 1-4)мкм, шириной 0,2-0,6мкм, слегка изогнутые более или менее зернистые. Микобактерии располагаются изолированно, либо парами или в виде групп, хорошо видны на голубом фоне мазка. Подсчитывают количество КУМ в мазке. Различную степень кислотоустойчивости, которая выявляется при окрашивании по Ziehl–Neelsen, можно наблюдать не только у разных видов микобактерий, но и у других микроорганизмов. Это могут быть различные виды Rhodococcus, Nocardia, Legionella, а также цисты Cryptosporidium и Isospora. Быстрорастущие микобактерии могут различаться по степени кислотоустойчивой окраски (в случае частичной потери кислотоустойчивости окраски они могут окрашиваться в фиолетово-малиновый цвет). В сомнительных случаях рекомендуется длительно (в течении 45-60 минут) обесцвечивать мазок в солянокислом спирте. Сапрофиты при этом теряют окраску и выглядят в виде палочек голубого цвета.