- •Утверждено
- •II. Показания к применению метода
- •III. Возможности метода микроскопического исследования при выявлении кислотоустойчивых микобактерий
- •IV.Сбор диагностического материала
- •V. Организация рабочего места и оборудование, необходимое для микроскопических исследований
- •VI. Транспортировка диагностического материала
- •VII. Правила работы с диагностическим материалом
- •7.1 Прием диагностического материала
- •VIII. Приготовление мазков для микроскопических исследований
- •8.1. Подготовка предметных стекол
- •8.2. Приготовление мазков из нативного материала
- •8.3. Приготовление мазка из осадка необработанного нативного материала
- •8.4. Фиксация мазков
- •IX.Методы окраски диагностических препаратов
- •9.1. Окраска препаратов для световой микроскопии по методу Ziehl–Neelsen
- •9.2. Оборудование и реактивы для окраски по методу Ziehl–Neelsen
- •Процедура окраски.
- •X.Техника микроскопического исследования препарата
- •XI. Учет и интерпретация результатов микроскопического исследования
- •XII. Регистрация результатов исследования
- •XIII. Метод люминесцентной микроскопии
- •13.1. Метод окраски аурамином оо и родамином с
- •13.2. Метод окраски аурамином о
- •XIV. Причины возможных ошибок при выполнении микроскопических исследований
- •14.1. Ложноположительные результаты могут быть обусловлены следующими причинами:
- •14.2. Ложноотрицательные результаты могут быть обусловлены следующими причинами:
- •Возможные причины неисправностей при проведении микроскопии и способы их устранения
- •XV. Контроль и обеспечение качества микроскопического выявления кислотоустойчивых микобактерий
- •XVI. Меры безопасности при работе с инфекционным материалом
- •Правила сбора мокроты.
- •Направление на бактериоскопическое исследование
- •Лабораторный журнал регистрации результатов бактериоскопических исследований
- •Перечень лабораторного оборудования, расходных материалов, реактивов и инструментария для бактериоскопических исследований.
- •Результаты бактериоскопического исследования
- •Форма для оценки работы лаборатории при внешнем контроле качества
- •Расчет числа ложноположительных и ложноотрицательных результатов.
Процедура окраски.
Промаркированные и фиксированные мазки помещают на подставку (“рельсы”) так, чтобы они не касались друг друга и расстояние между ними составляло 1 см. Не слудет окрашивать одновременно более 12 стекол. На каждый мазок накладывают полоску фильтровальной бумаги. На всю поверхность фильтровальной бумаги, покрывающей стекло, наносят раствор карболового фуксина. Вместо использования полосок фильтровальной бумаги можно карболовый фуксин налить через воронку со складчатым фильтром непосредственно на мазок. Медленно нагревают препарат над пламенем горелки до легкого появления паров. Не допускается кипение или полное испарение окрашивающего раствора на предметном стекле. Если раствора недостаточно, его нужно добавить еще и нагреть во второй раз. Подогретый мазок оставляют на 5 минут, чтобы краситель проник в клеточную стенку микобактерий и окрасил ее, после чего фильтровальную бумагу удаляют пинцетом и помещают ее в бачок для сбора отходов. Каждое предметное стекло аккуратно ополаскивают отдельно под слабой струей дистиллированной воды до полного удаления окрашивающего раствора. Мазок смывают ребром к струе. Не разрешается смывать и обесцвечивать одновременно несколько мазков во избежание перекрестной контаминации. Все стекла с мазками помещают на мостик и обрабатывают каждый из них индивидуально 25% раствором серной кислоты или солянокислым спиртом в течение 3 минут, полностью покрывая всю поверхность мазка. Смывают каждое предметное стекло, как описано выше. Воздействие раствора серной кислоты (или 3% раствора солянокислого спирта) приводит к обесцвечиванию всех некислотоустойчивых структур. Только микобактерии, обладающие кислото- и спиртоустойчивостью, стойко удерживают краситель и остаются окрашенными в красный цвет. Обесцвеченные элементы мазка дополнительно докрашивают 0,3% раствором метиленового синего в течение 60секунд, не превышая экспозиции. Промывают проточной водой, наклоняя каждое стекло, чтобы стекла вода и оставляют сушить на воздухе при комнатной температуре в вертикальном или наклонном положении. Не следует промокать препарат. Для предотвращения контаминации хранящихся реактивов запрещается сливать неиспользованные реактивы назад в бутыли.
В результате микобактерии туберкулеза окрашиваются в малиново-красный цвет, а другие микроорганизмы и клеточные элементы - в голубой. При использовании 0,3% раствора метиленового синего в случаях превышения времени окраски либо при толстом мазке этот краситель может как бы “скрыть” кислотоустойчивые микобактерии. В число исследуемых мазков, подлежащих окрашиванию, необходимо ежедневно включать контрольные неокрашенные (положительный и отрицательный) препараты. В начале микроскопируют контрольные мазки, а затем – мазки от больных.
Люминесцентная микроскопия мазка мокроты может проводиться в крупных лабораториях, где ежедневно исследуется более 30 мазков. Преимущество флуоресцентного метода микроскопии заключается в возможности просмотра большей площади мазка, поскольку при микроскопии мазков, окрашенных флуорохромами, используют объектив с меньшим увеличением. Однако использование объектива с меньшим увеличением увеличивает вероятность ложноположительных результатов вследствие ошибочного принятия артефакта за микобактерии. Поэтому все положительные мазки должны быть дополнительно просмотрены при большем увеличении. Кроме этого, необходима подтверждающая микроскопия мазков, окрашенных по Ziehl – Neelsen.
При окраске мазков флуорохромами необходимо:
избегать неполного обесцвечивания;
готовить достаточно тонкие мазки, поскольку излишняя толщина мазка препятствует качественному обесцвечиванию, а дополнительное докрашивание может скрыть наличие микобактерий. Кроме этого, толстые мазки плохо фиксируются на предметном стекле, в силу чего могут быть смыты в процессе окрашивания;
избегать чрезмерно интенсивного докрашивания, скрывающего наличие микобактерий.
Мазки, окрашенные флуорохромами, рекомендуется вновь использовать для окрашивания по методу Ziehl–Neelsen для подтверждения результатов микроскопии. Однако после этого они не пригодны для люминесцентной микроскопии.