- •Утверждено
- •II. Показания к применению метода
- •III. Возможности метода микроскопического исследования при выявлении кислотоустойчивых микобактерий
- •IV.Сбор диагностического материала
- •V. Организация рабочего места и оборудование, необходимое для микроскопических исследований
- •VI. Транспортировка диагностического материала
- •VII. Правила работы с диагностическим материалом
- •7.1 Прием диагностического материала
- •VIII. Приготовление мазков для микроскопических исследований
- •8.1. Подготовка предметных стекол
- •8.2. Приготовление мазков из нативного материала
- •8.3. Приготовление мазка из осадка необработанного нативного материала
- •8.4. Фиксация мазков
- •IX.Методы окраски диагностических препаратов
- •9.1. Окраска препаратов для световой микроскопии по методу Ziehl–Neelsen
- •9.2. Оборудование и реактивы для окраски по методу Ziehl–Neelsen
- •Процедура окраски.
- •X.Техника микроскопического исследования препарата
- •XI. Учет и интерпретация результатов микроскопического исследования
- •XII. Регистрация результатов исследования
- •XIII. Метод люминесцентной микроскопии
- •13.1. Метод окраски аурамином оо и родамином с
- •13.2. Метод окраски аурамином о
- •XIV. Причины возможных ошибок при выполнении микроскопических исследований
- •14.1. Ложноположительные результаты могут быть обусловлены следующими причинами:
- •14.2. Ложноотрицательные результаты могут быть обусловлены следующими причинами:
- •Возможные причины неисправностей при проведении микроскопии и способы их устранения
- •XV. Контроль и обеспечение качества микроскопического выявления кислотоустойчивых микобактерий
- •XVI. Меры безопасности при работе с инфекционным материалом
- •Правила сбора мокроты.
- •Направление на бактериоскопическое исследование
- •Лабораторный журнал регистрации результатов бактериоскопических исследований
- •Перечень лабораторного оборудования, расходных материалов, реактивов и инструментария для бактериоскопических исследований.
- •Результаты бактериоскопического исследования
- •Форма для оценки работы лаборатории при внешнем контроле качества
- •Расчет числа ложноположительных и ложноотрицательных результатов.
IX.Методы окраски диагностических препаратов
Для окраски мазков, приготовленных непосредственно из диагностического материала (метод прямой микроскопии), используется метод Ziehl–Neelsen.
При большом количестве используемых ежедневно мазков в целях ускорения процедуры микроскопии практикуется использование люминесцентной микроскопии.
Для исследования мазков, окрашенных по Ziehl–Neelsen, используется световой бинокулярный микроскоп с иммерсионным объективом 90Х или 100Х и окулярами 7Х и 10Х либо монокулярный микроскоп, оснащенный бинокулярной насадкой.
Для исследования мазков, окрашенных флюорохромными красителями, используют люминесцентный микроскоп с набором объективов для люминесцентной микроскопии и окуляров, позволяющих получить увеличение объекта наблюдения в пределах 250Х – 630Х.
9.1. Окраска препаратов для световой микроскопии по методу Ziehl–Neelsen
Метод окраски по Ziehl – Neelsen для выявления кислотоустойчивых микобактерий основан на следующих специальных методических приемах:
окраска карболовым фуксином (с подогреванием) – при одновременном воздействии нагревания и сильного протравливающего действия карболовой кислоты повышается способность красителя проникать в структуру клеточной стенки микобактерий, состоящей из липидов, миколовых кислот и восков. Обычные анилиновые красители не проникают в клеточную стенку микобактерий и последние не окрашиваются;
обесцвечивание (3 мин) – последующая обработка мазка 25% раствором серной кислоты или 3% раствором солянокислого спирта приводит к обесцвечиванию красителя, проникшего в структуры, не обладающие достаточностью гидрофобностью и стойкостью к разрушению в кислоте (кислотоустойчивостью). Только кислото- и спиртоустойчивые микроорганизмы стойко удерживают краситель и остается после обесцвечивания окрашенными в малино-красный цвет;
контрастирующая окраска (1 мин) – обесцвеченные элементы мазка докрашиваются метиленовым синим для контрастности препарата.
9.2. Оборудование и реактивы для окраски по методу Ziehl–Neelsen
Для окраски мазков по методу Ziehl–Neelsen необходимы:
раковины или специальный лоток для окраски;
специальный штатив “рельсы” для окраски предметных стекол с мазками;
пинцеты для взятия предметных стекол;
спиртовая горелка для фиксации мазков (если они не фиксированы в сушильном шкафу) и подогревания при окрашивании карболовым фуксином;
фильтровальная бумага размером 4х1,5см для окраски мазков карболовым фуксином;
раствор карболового фуксина;
25% раствор серной кислоты или 3% раствор солянокислого спирта;
дистиллированная вода для промывки мазков;
0,3% раствор хлорида метиленового синего;
штатив для просушивания окрашенных стекол на воздухе в вертикальном или наклонном положении.
Приготовление растворов:
Раствор 1. Насыщенный спиртовой раствор фуксина:
-растереть с ступе 0,3г. основного фуксина с 2-3 каплями глицерина и добавить по каплям 10 мл 96° этилового спирта.
Раствор 2. Рабочий раствор фенола (5-% водный раствор):
-медленно нагревают 5г кристаллического фенола во флаконе до жидкого состояния на водяной бане и добавляют слегка подогретую дистиллированную воду до объема 100мл.
Раствор 3. Рабочий раствор карболового фуксина:
-в 90 мл полученного раствора фенола (2) добавляют 10 мл насыщенного раствора фуксина (1).
Раствор 4. Обесцвечивающие растворы:
а) 25% раствор серной кислоты.
К 75 мл дистиллированной воды осторожно долить 25 мл концентрированной серной кислоты, наслаивая ее по стенке сосуда, смешивают. Никогда не добавляйте воду в кислоту!
В место раствора серной кислоты для обесцвечивания можно использовать 3% солянокислый спирт.
б) раствор 3% солянокислого спирта:
концентрированная соляная кислота – 3мл,
96°этиловый спирт – 97мл
аккуратно добавляют 3мл концентрированной соляной кислоты к 97мл спирта.
Никогда не вливайте спирт в соляную кислоту!
Раствор 5. Рабочий раствор метиленового синего:
-растворить 0,3г хлорида метиленового синего в 100мл дистиллированной воды.
Все приготовленные растворы должны быть профильтрованы через бумажный фильтр и помещены в закрытые емкости из темного стекла и храниться при комнатной температуре в темном месте. На каждой емкости должна быть надпись с названием раствора, датой его приготовления, сроком годности и указанием фамилии лаборанта приготовившего раствор.
Рабочий раствор карболового фуксина может храниться не более 2-х недель, так как после этого срока фуксин начинает выпадать в осадок, что ведет к изменению его красящих свойств. Другие рабочие растворы более стойки при хранении. Однако рекомендуется готовить их каждые 2 недели, одновременно с раствором карболового фуксина.