35. Клондалуға арналған гендерді промоторға қатысты бір бағытта орналастыру.

Кез келген геннің эффективті экспрессиясы үшін сол геннің алдында орналасқан күшті промотор қажет. Промоторды дұрыс бағыттау клеткаға транкрипцияны қатаң бақылауға мүмкіндік береді. клондалған гендердің экспрессиясы үшін промоторлар қолданылады: lac- оперонының промоторы, trp- оперонының промоторы, tac- промоторы (триптофан промоторы мен lac- оперонының промоторының қосылуынан алынған гибрид, lac промоторының он аймағынан, триптофан промоторының отыз бес аймағынан тұрады), λ бактериофагының p^l промоторы, Т7 бактериофагының оныншы генінің промоторы. Бұл промоторларының әр қайсысы сәйкес репрессорлармен байланысады, сонымен қатар РНҚ полимеразаның холоферменттімен танылады. Ортада лактоза болмағанда lac промотор репрессиялық күйде болады. Lac опероны ортаға лактозаны немесе изопропил β-D- тиогалактопиранозида қосқанда активтеледі. Бұл қосылыстар репрессордың lac оператормен байланыспауына мүмкіндік береді және транскрипция жаңарады. Триптофан промоторы триптофан операторымен байланысып, триптофан оперонының транкрипциясын жүзеге асырмайтын триптофан-trp- репрессор комплексінің қатысында активтенеді.

p^l промоторының жұмысы λ бактериофагының СІ репресорлы белогымен қадағаланады. T7 бактериофагының промоторы үшін сәйкес РНК полимераза қажет. Бұл промоторды қолдану үшін T7 фагының РНҚ полимеразасының генін E.coli хромосомасына lac промоторының бақылауында енгізеді. T7 промоторының бақылауындағы нысана гені бар плазмидамен клетканы трансформациялайды, ортаға ИПТГ қосады. Осындай жағдайларда T7 РНҚ полимераза гені активтеледі, РНҚ полимераза синтезделеді және клондалған геннің транскрипциясы мен трансляциясы жүреді.

36. Тізбекті полимеразалық реакция, оның гендік инженериядағы қолданылуы

Полимеразалық тізбекті реакция (ПТР) – биологиялық сынамадағы нуклеин қышқылдарының белгілі-бір фрагментінің аз ғана концентрациясын көбейтуге мүмкіндік беретін молекулалық биологияның экспериментальдық әдісі.

ПТР ДНҚ-ны амплификациялауда ғана емес, сондай-ақ нуклеин қышқылдарымен әртүрлі манипуляция жасауға (мутацияға кіріспе, ДНҚ фрагменттерін көбейту және т.б.) мүмкіндік береді және биологиялық медициналық практикада кеңінен қолданылады, мысалы, әртүрлі ауруларды анықтауда (тұқым қуалайтын, жұқпалы аурулар), установления отцовства, гендерді клондауда, жаңа гендерді бөліп алуда кеңінен қолданылады.

Полимеразалық тізбекті реакцияны (ПТР) 1983 жылы американдық биохимик Кэри Муллис ашқан. Оның басты мақсаты берілген ДНҚ фрагментін ДНҚ-полимераза ферментінің қатысында бірнеше қайтара ДНҚ-ны амплификациялау нәтижесінде көптеген көшірмелерді алу болды.

ПТР әдісі белгілі ДНҚ фрагментін in vitro жағдайында ферменттердің қатысуымен бірнеше қайтара таңдамалы түрде көшіруге негізделген. ПТР тірі организмдерде жүзеге асатын ДНҚ амплификациясынан (репликация) ерекшелігі ДНҚ-ның қысқа тізбекті үзінділері көшіріледі. Қалыпты ПТР-процессінде ДНҚ үзінділерінің ұзындығы 3000 жұп нуклеотидті құрайды. Әртүрлі полимеразалық қоспалардың көмегімен және әртүрлі қоспалардың көмегімен белгілі бір жағдайларда ПТР-фрагменттерінің ұзындығы 20-40 мың жұп нуклеотидке дейін жетуі мүмкін.

Реакция компоненттері

• Амплификациялауға қажет ДНҚ фрагменті бар – ДНҚ марица;

• Қажетті ДНҚ фрагментінің әртүрлі ұштарына комплементарлы – екі праймер;

• Полимеразалық реакцияларды катализдейтін термотұрақты фермент – ДНҚ-полимераза; ПТР-ді жүзеге асыру үшін қажетті ДНҚ-полимераза жоғары температурада да өзінің активтілігін сақтап қалуы керек. ПТР-ге қажетті ДНҚ полимеразалар термофильді бактериалардан бөлініп алынған: Thermus aquaticus (Taq-полимераза), Pyrococcus furiosus (Pfu-полимераза), Pyrococcus woesei (Pwo-полимераза) және т.б.

• Дезоксирибонуклеозидтрифосфаттар (dATP, dGTP, dCTP, dTTP);

• Полимеразаның жұмысына қажетті Mg²⁺ ионы.

• Реакцияға қажетті жағдайларды (рН, ерітіндінің иондық күші) қамтамасыз ететін – буфер ерітіндісі. Құрамында тұздар мен бұқаның қан сарысу альбумині болады.

Сондай-ақ ПТР реакцияларының ингибиторлары ретінде пирофосфаттар қолданылуы мүмкін.

Праймерлер

ПТР-ді жүзеге асыру матрицалық ДНҚ мен праймер арасында комплементарлы комплекс түзуге негізделген. Праймерлер – ұзындығы 18-30 нуклеотид негізінен тұратын синтетикалық олигонуклеотидтер. Әр праймер амплификациялауға қажетті матрицалық ДНҚ фрагментінің екі тізбегіне коплементарлы болып келеді және амплификацияланатын участоктың басын және аяғын шектеп отырады.

Праймерлерді таңдау кезінде келесі критерийлерді ұстану керек:

• GC-құрамы ~ 40—60%;

• Шпилка мен димерлер болмау керек;

• 3’- соңында гуанин немесе цитозин болғаны дұрыс, себебі бұлардың арасында үш сутектік байланыс түзіледі.

Амплификатор – ПТР жүргізуге арналған аппарат. Амплификатор – периодты түрде қыздыру және суытуды қамтамасыз ететін прибор.

ПТР жүргізу үшін 20-35 цикл жүргізіледі. Әрқайсысы үш сатыдан тұрады: денатурация, гибридизация немес жасыту, элонгация.

Денатурация

Қостізбекті ДНК матрицасын жарты –екі минутқа 94-96 градусқа дейін қыздырады ,содан кейін ДНк тізбектері ажырайды.Бұл саты денатурация деп аталады.денатурация кезінде ДНк-ның қос тізбектерінің арсындағы сутектік байланыс үзіледі.матрица мен праймердің толық денатурациялануы үшін полимеразаны қоспас бұрын алдын ала қоспаны екі –үш минут қыздырады.

Гибридизация немесе жасыту.Тізбектер ажырағанда температураны төмендетеді, сонда реакциядағы бөгде заттардың саны азаяды. праймерлердің бір тізбекті матрицамен байл. байланысуы жасыту сатысы деп аталады.жасытудың температурасы праймердің құрамына және балқуына байланысты болады.

Жасытудың температурысы дұрыс таңдалмаса, праймер мен матрицаның байланысуына кері әсер етеді.жасытудың уақыты отыз секундта жүреді, осы уақытта полимераза көптеген нуклеотидтерді синтездеп үлгереді. Сондықтан праймерлердің балқу температурасы алпыс градустан жоғары таңдалуы керек және жасыту мен элонгация сатылары бір уақытта алпыс -жетпіс екі градуста жүргізілуі керек. Элонгация.ДНК полимераза матрицалық тізбекті праймер көмегімен репликациялайды.полимераза екінші тізбектің синтезін праймердің 3'соңынан бастайды.

ПТР ді жүргізу барысында ең алдымен термиялық денатурация жүргізіледі. Денатурация кезінде қос тізбекті ДНК жеке жеке тізбектерге ыдырайды. Ол 93-95 ⁰ та жүзеге асады. Кейін сынама 60 ⁰ қа дейін суытылады. Бұл тізбектердің праймермен байланысуына жағдай туғызады. Праймерлер қос тізбектің қайтадан байланысып қалмауын қамтамасыз етеді. Кейін сынаманы 70 ⁰ қа жеткізеді. Бұл температура Taq – полимеразаның (Термотұрақты ) активтелуіне акеледі.

Праймерлерді таңдау.Праймерлерді әдетте химиялық синтез арқылы бөліп алады. Оны амплификацияланатын ДНК бөлігінің шеткі нуклеотидтер тізбегін алдын ала анықтап соған сәйкестендіреді.

Егер алдын ала керекті тізбектерді анықтау мүмкіндігі болмаса онда кездейсоқ праймерлер алынады. Оларға қойылатын шарт ДНК мен байланысуға қабілетті болу керек.

Праймерлер көбінесе 3’ соғына жалғанады. Праймерлердің басты қызметі ДНК полимераза қызметін шектеу, яғни тек қана керекті нуклеотидтер тізбегін синтездеуге көмектеседі.

ПТР реакциялары көбінесе циклды. ПТР циклын бірнеше рет қайталағанда керекті нуклеотид тізбектерінің (ген) өте көп мөлшерде алуға болады.