8. Днқ тізбегін анықтаудың химиялық әдісі (Максам-Гильберт).

Днк нің молекуласы күрделілігі себепті оның құрамын анықтау өте киын. ДНК молекуласына анализ жасау 1977 ж. бастап мүмкін болды.Бір мезгілде екі түрлі әдіс пайда болды.Олар: химиялық әдіс. Оны ДНК ны анықтауда қолданғандар американдық Максам мен Гильберт.Екінші әдіс ферменттік әдіс, оның авторы Сенгер болатын.Химиялық әдіс бойынша(Максам Гильберт әдісі) ДНК ның 5^´ ұшын Р³² мен (радиоактивті фосфор ) таңбалайды. Содан кейін молекуланы ыдыратады. Ол үшін ДНК ға гидрозин немесе димитил сульфатпен әсер етеді.Димитилсульфат ДНК дағы гуаниннің үш азотын митилдейді.(N-CH3) ДНК ны қыздырғанда молекуланың митилденген нуклеотидтері бөліне бастайды, егер әлсіз қышқылмен әсер етіп қыздырса онда негізінен аденин болініп қалады. Гидрозин ДНК дағы цитазин мен тиминнің молекуладағы байланысын әлсіретеді.Егер ол нуклеотидтерді бөлуді 2М NaCL қатысуымен жүргізсе, онда цитазин ғана молкуладан ажырайды. Жоғарыдағы реакциялардың әсерінен ДНК әсерінен ДНК молекуласы бірнеше бөлшектерге (фрагменттерге )бөлінеді.Ол бөлшектерді электрофорездің күшімен бір бірінен айырады.Көп бөлшектердің басында 5^´ жағында радиоактивтік Р³² болатындықтан оларды көруге болады, яғни электрофореграммада орнын өте дәл айыруға мүмкіндік бар.Ол үшін одан авторадиограмма жасайды.Бөлшектердің бөліну жылдамдығына қарап оның неше нуклеотидтерден тұратындығын және бөлінген нуклеотидтердің орнын анықтайды.Неғұрлым бөлшектердің нуклеотид аз болса соғұрлым оның жылдамдығы жоғары болады.Бөлшектенген ДНК ның бірінші нуклеотидінде Р³² болатындықтан одан кейінгі әр бөлшекте нуклеотидтердің орналасу ретін анықтау жеңіл болады.Мысалы 5^´ ГЦТАЦГТА -3’ 5’ тың құрамында радиоактивті Р³² бар.Егер ДНК ны ыдыратса онда Р³² бар мынадай бөлшектер пайда болар еді:

А ны алса : Р³² ГЦТ

Р³² ГЦТАЦГТ

Г ны алса: Р³² ГЦТАЦ

Ц ны алса: Р³² Г

Р³² ГЦТА

Т ны алса: Р³² ГЦ

Р³² ГЦТАЦГ

Электрофорез көмегімен алынған бөлшектер нуклеотид санына қарай орналасады.Және радиоавтография олардың орнын анықтауға мүмкіндік береді.

11. Траспозондардың геномды жылжу механизмдері. Транспазаза және репрессорлары.

Транспозон

дардың  геномда жылжуының  механизмдері. Транспозаза және оның репрессорлары.

IS-элементтер (ағылшын тілінде insertion sequences – ендіру-тізбектері) – бір орныққан локализацияланған орнынан басқа бір екінші участокке толық орын ауыстыра алатын ДНК сегменті.

IS-элементтерінің құрамында өзінің бір жерден екінші жерге орын ауыстыруына транспозициясына жауапты гендер ғана болады. Сонымен қатар IS-элементтерінің екі ұшында ерекше қайталамдардан тұратын инвертирленген тізбектері болады. IS-элементтері қожайын клеткасының геномына бекінген кезде кішігірім дупликацияны шақырады, өзінің бекінген жерінің екі шетінен дупликациялайды.

Транспозондар (Tn-элементтер) IS-элементтерге ұқсас ДНК сегменттері, бірақ бұлардың құрамында өзінің транспозициясына жауапты тізбектермен қатар, клетка метаболизміне жауапты немесе антибиотиктерге төзімділікті кодтаушы тізбектері болады. Қысқасы, транспозондарда плазмидаларға тән қасиет болады. Жақын орналасқан екі IS-элементтері бір орыннан екінші орынға бірге орын ауыстырып жүре алады. Кейбір кездерде екі IS-элементтерінің ортасында бір мезгілде ДНК фрагментін қоса алып жүруі мүмкін, сөйтіп екі IS-элементтері транспозондар түзуі мүмкін.

Транспозондар мен IS-элементтері бактерия клеткасындағы бірқатар генетикалық құбылыстарға жауапты. Қандай да бір генге мобильді элементтерді енгізу сол геннің инактивациясына әкелуі мүмкін. Сондай-ақ IS-элементтері мен транспозондар өздері орналасқан аймаққа жақын гендердің тұрақтылығын өзгертуі мүмкін. IS-элементтері мен транспозондар орналасқан жақын аймақтардағы гендерде делеция немесе инверсия жиі болатындығы анықталған. Мобильді элементтер сонымен қатар транслокацияны шақыруы мүмкін.

Бактериальды мобильді элементтердің орын ауыстыру механизмдері. Бір геномнан екінші геномға орын ауыстырудың транспозицияның екі типі бар.

Коинтеграционды деп аталатын бірінші типті транспозиция барысында IS-элементтері немесе транспозондары бар донорлық геном рецепиен ДНК молекуласымен құйылысуы жүзеге асады. Клетканың репликативті жүйесінің репликациялануы нәтижесінде мобильді элемент екі еселенеді. Мобильді элементтің дупликациялануымен аралық коинтегрант түзіледі. Коинтегрантты репликондарға ажырату үшін (біреуі мобильді элементтің көшірмесі болу үшін) резолваза (ағылшын тілінде resolution – кесу, шешу) деп аталатын tnpR генінің өнімі қажет. Резолваза коинтегрантты репликаторларға кеседі.

Екінші типті транспозиция қарапайым бекіну деп аталады. Мобильді элемент жаңа геномдық локусқа барып орын ауыстырады, бұл кезде нысана-сайттың дупликациялануынан (екі еселенуінен) басқа ешқандай өзгерістер жүрмейді. Транспозицияның бұл тәсілін кей жағдайда консервативтік (репликативті емес) механизмі деп атайды. Процесті аяқтау үшін ДНК-ның аз ғана репаративті синтезі қажет.

IS-элементтер (ағылшын тілінде insertion sequences – ендіру-тізбектері) – бір орныққан локализацияланған орнынан басқа бір екінші участокке толық орын ауыстыра алатын ДНК сегменті.

IS-элементтерінің құрамында өзінің бір жерден екінші жерге орын ауыстыруына транспозициясына жауапты гендер ғана болады. Сонымен қатар IS-элементтерінің екі ұшында ерекше қайталамдардан тұратын инвертирленген тізбектері болады. IS-элементтері қожайын клеткасының геномына бекінген кезде кішігірім дупликацияны шақырады, өзінің бекінген жерінің екі шетінен дупликациялайды.

Транспозондар (Tn-элементтер) IS-элементтерге ұқсас ДНК сегменттері, бірақ бұлардың құрамында өзінің транспозициясына жауапты тізбектермен қатар, клетка метаболизміне жауапты немесе антибиотиктерге төзімділікті кодтаушы тізбектері болады. Қысқасы, транспозондарда плазмидаларға тән қасиет болады. Жақын орналасқан екі IS-элементтері бір орыннан екінші орынға бірге орын ауыстырып жүре алады. Кейбір кездерде екі IS-элементтерінің ортасында бір мезгілде ДНК фрагментін қоса алып жүруі мүмкін, сөйтіп екі IS-элементтері транспозондар түзуі мүмкін.

Транспозондар мен IS-элементтері бактерия клеткасындағы бірқатар генетикалық құбылыстарға жауапты. Қандай да бір генге мобильді элементтерді енгізу сол геннің инактивациясына әкелуі мүмкін. Сондай-ақ IS-элементтері мен транспозондар өздері орналасқан аймаққа жақын гендердің тұрақтылығын өзгертуі мүмкін. IS-элементтері мен транспозондар орналасқан жақын аймақтардағы гендерде делеция немесе инверсия жиі болатындығы анықталған. Мобильді элементтер сонымен қатар транслокацияны шақыруы мүмкін.

Бактериальды мобильді элементтердің орын ауыстыру механизмдері. Бір геномнан екінші геномға орын ауыстырудың транспозицияның екі типі бар.

Коинтеграционды деп аталатын бірінші типті транспозиция барысында IS-элементтері немесе транспозондары бар донорлық геном рецепиен ДНК молекуласымен құйылысуы жүзеге асады. Клетканың репликативті жүйесінің репликациялануы нәтижесінде мобильді элемент екі еселенеді. Мобильді элементтің дупликациялануымен аралық коинтегрант түзіледі. Коинтегрантты репликондарға ажырату үшін (біреуі мобильді элементтің көшірмесі болу үшін) резолваза (ағылшын тілінде resolution – кесу, шешу) деп аталатын tnpR генінің өнімі қажет. Резолваза коинтегрантты репликаторларға кеседі.

Екінші типті транспозиция қарапайым бекіну деп аталады. Мобильді элемент жаңа геномдық локусқа барып орын ауыстырады, бұл кезде нысана-сайттың дупликациялануынан (екі еселенуінен) басқа ешқандай өзгерістер жүрмейді. Транспозицияның бұл тәсілін кей жағдайда консервативтік (репликативті емес) механизмі деп атайды. Процесті аяқтау үшін ДНК-ның аз ғана репаративті синтезі қажет.

Бактериялық мобильді генетикалық элементтер екі түрлі болуы мүмкін:

1. IS (insertion sequens- инсерциялық тізбек)

2. Tn-элементтер (транспозондар)

Екі элемент те бактериялық геномда орын ауыстыруға қабілетті, нәтижесінде әр түрлі мутациялардың шығу көзі болып саналады. Бұл мутациялар геннің әсерін толық тежеп тастайды. Инсерциялық тізбектер салыстырмалы ұзын емес және ол өзінің транспозициясын ғана коделейді. IS-элементтердің ұштары инверсиялы қайталанатын тізбектерден құралған. Транспозондар болса, өзінің транспозициясын кодтайтын гендерден басқа бактерияның қосымша қасиеттерін сипаттайтын гендері бар. Транспозондар және инсерциялық элементтер бактериялық плазмидалардан жиі табылды, олардың басым көпшілігі төзімділік R-факторымен байланысқан және де бактериялық клетканың антибиотиктерген, ауыр металдардың иондарына төзімділігін анықтауға қатынасады. Сонымен IS және Tn-элементтерінің орын ауыстыра алу қабілеттілігі генетикалық инженерия үшін белгілі маңызы бар.

Барлық организмдерде байқалатын өзгергіштік пен тұрақсыздықтың басты себебі, осы жылжымалы генетикалық элементтер болуы мүмкін. Өйткені олар қасындағы көршілес басқа гендердің экспрессиясын тоқтатады немесе басқа жолдармен де ықпал етеді. Олар клеткада көптеген тұқым қуалайтын өзгерістер туғызады, себебі инсерциялық мутагенезді қоздырады. Инсерция деген ДНҚ молекулалардын генге тіркесуі, соның нәтижесінде ген инактивтелінеді немесе оперонда күшті полярлық эффект байқалады. Хромосомалардың әр түрлі жерлеріне тіркесіп, олар клеткалық гендердің активтілігін тежейді немесе арттырады, яғни хромосоманың құрылымы өзгереді. Сонымен, жылжымалы гендер өздерінің орнын өзгертуі (транспозиция) арқасында клетканың генетикалық тұрақсыздығына, мутагенезге және хромосомалардың аберрацияларына түрткі болады.

Осындай ДНҚ бөліктерінің геном бойы жылжып орын ауыстыруының механизмі белгісіз. Мүмкін, жылжымалы гендер өздерінің аумалылығын және репликациясын қамтамасыз ететін арнаулы белоктарды кодтайды. Әдетте, жылжымалы генетикалық элементтер геномда көп рет қайталанады, хромосомаларда кездейсоқ орналасады, транспозаза арқылы олар геномда орнын ауыстыра алады. Транспозаза деп жылжымалы элементтермен ерекше әрекеттесіп, оларды хромосомадан кесіп бөліп алатын ферментті атайды. Егер жылжымалы элемент дәл кесіп алынса, онда ДНҚ-ның бұрынғы құрылымы өзгермейді. Бірақта кейде бұл процесс нақты өтпейді, сондықтан кейбір нуклеотидтердің делециясы(жойылуы) немесе инсерциясы (қосымша пайда болуы) орын алады. Соның нәтижесінде тұрақты мутациялар пайда болады. Демек, бұл құбылысты жаңа ДНҚ тізбектерінің жасалу механизмдерінің бірі деп есептеуге болады.

Жылжымалы гендердің ұзындығы бірнеше мың нуклеотидтер жұбы. Олар ДНҚның ерекше бөлігі. Бұл бөліктің екі жақ шетінде біріне бірі комплементарлық қарама қарсы айналған, қайталанған тізбектері болады. Бөліктің ішкі жағында транспозазаны кодтайтын ген орналасқан.

Бактерияларда жылжымалы гендердің ұзындығы мен құрылымы жағынан айырмашылығы бар екі негізгі классы анықталған:

.Инсерциялық тізбектер немесе IS-элементтері, ұзындығы бір мыңдай нуклеотидтер жұбы, құрам---нда ауыспалылыққа жауапты тек бір ғана гені бар; Ұзындығы 3-20 мнж, құрамында әр түрлі улы заттарға бактериялардың төзімді болуын қамтамасыз ететін бірнеше қоымша гендері бар.