17. Рекомбинантты днқ-ны прокариот жуйелеріне трансформациялау әдістері.

Трансформация –рекомбинантты ДНҚ-ны реципиент немесе қожайын клеткаға енгізу әдісі. Гибридті молекулаларды клеткаға енгізу тәсілдеріне: электропарация, жоғары температуралық шок және кальций тұздарымен өңдеу жатқызылады. Кальций тұздары негізіндегі трансформация бактерия клеткаларын өңдегенде, олардың мембраналарының ДНҚ-ны өткізе алатындағына негізделген. Бөтен ДНҚ-ның клеткаға ену тиімділігі төмен. Алдын ала кальций тұзымен өңделген клеткаға, мысалы, 1 мкг рВR322 плазмидасын қосса, онда әрбір 10*4-10*5 плазмиданың біреуі ғана клекта ішіне енеді, яғни бактериялардың азғантай бөлігі ғана трансформациялана алады. Оларды басқалардан бөлу бактерия клондарын алу процесінде іске асады. Әдетте, модификацияланған ДНҚ молекуласын (метилаза ферментімен метильденбеген) бактерия клеткасының рестрикциялық ферменттері ыдыратып жібереді. Ал клеткаға рекомбинантты ДНҚ-ның көп мөлшерін енгізсе, онда оның рестриктазалары оларды ыдыратып үлгере алмайды. Бактериялық рестриктазалар үзіп үлгермеген рДНҚ-ның біраз бөлігі рестриктаза танитын орындарда метилденіп –модификацияланып кетеді.

Клеткалық мембрананы электр тогымен қоздыру нәтижесінде рекомбинантты ДНҚ-ның клеткаға трансформациялану әдісі электропарация деп аталады. Электропарация барысында қожайын немесе реципиент клеткаға ДНҚ-ны енгізеді, сосын оны кюветаға құйып, заряд жібереді. Одан соң 2кВт элетр өрісі пайда болады. Электр өрісі пайда болған кезде жылдамдығы 4,5мс импульспен әсер ете отырып клеткалық мембрананы зақымдайды. Нәтижесінде пайда болған тесіктер арқылы рекомбинантты ДНҚ ішке енеді.

Ал температуралық шокпен әсер еткенде алдымен CaCl2 ерітіндісімен өңдейді де, содан барып рекомбинантты ДНҚ-ны енгізіп температураны бірден 42 ᵒС-қа көтергенде клеткалық мембранасы жыртылып, рДНҚ трасформацияланады.

18. КДнқ синтезі және оны клондау. Кері транскриптаза ферментіне сипаттама және олардың қолданылуы.

кДНҚ ВИЧ-1 және ВИЧ-2 ретровирустарыннан түзіледі, содан кейін қожайын клеткасының геномына провирус ретінде интегрирленеді. Эукариоттардың генінің прокариоттардан айырмашылығы –эукариоттардың гені мазайкалы болып келеді, экзон және интрон аудандарынан тұрады. Экзон – мағыналы аудан, ал интрон – мағынасыз аудан. Интрон аудандары сплайсинг нәтижесінде алынып тасталады. Прокариот гендерінде интрон аудандары болмайды, сол себептен оларда спалайсинг жүрмейді. Эукариот гендерін прокариот клеткаларында экспресиялауға болады. Әдістің негізі эукариот ДНҚ-сын прокариот геномына енгізу, одан соң мРНҚ-да ДНҚ транскрипциясы, содан соң мРНҚ-ның белоктарға трансляциялануы. Прокариот клеткасында интрондарды кесетін ферменттер болмайды. Сол себепті эукариот ДНҚ интрондары прокариот геномына енгізілмес бұрын кесіліп алынуы иіс.

Жетілген мРНҚ-ға комплементарлы ДНҚ кДНҚ деп аталады. Эукариоттардың кДНҚ-сында кодталған белоктары прокариоттарда сәтті экспрессиялануы үшін, прокариот гендерінің регуляторлық элементтері қажет (мысалы промоторлар).

Қос тізбекті кДНК –ның poly (А)+мРНК ға ферментативті синтезделуі және бұл ДНҚ-ны бактериялық плазмидаға енгізу эукариоттардың молекулалық биологиясының негізгі әдісі болып табылады. Кең таралған әдісіне:

• кері транскриптаза көмегімен кДНК-ның бірінші тізбегінің синтезделуі;

• сілтілік гидролиз арқылы РНК-матрицаны жою;

• Е.coli дің ДНК-полимеразасының қатысуымен ДНК-ның екінші тізбегінің синтезі;

• Нуклеин қышқылдарының бір тізбекті аудандарын спецификалық зақымдайтын S1 нуклеазасының көмегімен кДНК-ның бірінші және екінші тізбектерін байланыстыратын ілмекті ыдырату;

кДНК-ның бірінші тізбегінің синтезі:

гетерогенді мРНК популяцияларымен жұмыс жасаған кезде келесі жағдайларды қолданады:

• Кері транскриптаза

• рН 8,3

• Бірвалетті катиондар (калий иондарын пайдаланған кезде , натрий иондарын пайдаланғанмен салыстырғанда ұзынырақ транскриптер алуға болады) және еківалентті катиондар( еківалентті катиондар кері транскриптазаның белсенділігін қамтамасыз ету үшін қажет,)

-Дезоксирибонуклеозидүшфосфаттар  (кДНК-ның эфективті синтезі үшін әр Дезоксирибонуклеозидүшфосфаттардың жоғары концентрацияларын қолдану маңызды. Егер олардың біреуінің концентрациясы 10-50мкм –ден төмен түссе толық өлшемді транскриптер саны азаяды.)

кДНК ның екінші тізбегінің синтезі

Бір тізбекті кДНК ның 3' ұшында кДНК ның екінші тізбегінің синтезі кезінде E.coli дің ДНК-полимеразасының немесе кері транскриптазаның көмегімен затравка ретінде пайдалануға болатын ілмек тәрізді структуралар пайда болуы мүмкін.