6. Рестрикциялық эндонуклеазалар. Олардың классификациясы.

Рестрикциялық эндонуклеазалар (лат. Restrictio –тежеу) – нуклеин қышқыддарының гидролиз реакциясын катализдейтін гидролазалар тобына жататын ферменттер тобы. й

Экзонуклеазалардан айырмашылығы рестриктазалар нуклеин қышқылдарын соңынан емес ортасынан үзеді. Әр рестриктаза ДНҚ ның белгілі бір бөлігін танып сол сол бөліктің нуклеотидтер тізбегін үзеді.

Бактериалдық геномның өз рестриктазасынан қорғанышы аденин және цитозин қалдықтарының метилденуі арқылы жүзеге асады.

Классификация

Танитын сайттары симметриялық (палиндромды) және симметриялық емес болатын Рестрикция ферменттерінің негізгі 3 типі бар:

• Бірінші тип рестриктазалары (мысалы, ЕсоК из Escherichia coli К12) белгілі бір нуклеотидтер тізбегін танып, осы тізбектің маңындағы қос тізбекті ДНҚ молекуласын кез келген нүктеден үзеді, және үзу нүктесі қатаң түрде белгілі бір нүкте емес. (по-видимому, после образования комплекса с ДНК фермент неспецифически взаимодействует с удалённой областью ДНК или передвигается вдоль цепи ДНК).

• Екінші тип рестриктазалары (мысалы, EcoRI) белгілі бір тізбекті танып, қос тізбекті ДНҚ ны осы тізбектің ішінде белгілі бір бекітілген нүктеден үзеді. Бұл тип рестриктазалары орталық осінен екі бағытта да симметриялы палиндромды тізбектерді таниды.

• Үшінші аралық тип рестриктазалары (мысалы, EcoPI) керекті тізбекті танып, қос тізбекті ДНҚ ны сол тізбектің соңынан кейінгі нуклеотидтер жұбының белгілі бір санынан кейін(немесе тану сайтынан әртүрлі қашықтықта бірнеше нүктеден) үзеді.

Нәтижесінде ) 5' немесе 3'- жабысқақ не түзу соңды ДНҚ фрагменттері пайда болады. Бұл рестриктазалар ассиметриялық сайттарды таниды.

Изошизомерлер — бірдей тізбектерді танитын рестрикциялық эндонуклеазалар жұбы. Кейде метилденген нуклеотидтер қалдықтарының болуымен ерекшеленеді. Мысалы Sph I (CGTAC^G) және Bbu I (CGTAC^G).

Тану мен спецификалық үзу үшін рекшеленген алғашқы фрагмент прототип деп аталады, ал қалған рестриктазалар изошизомерлер деп аталады. Оларды әр түрлі бактерия штаммдарынан бөліп алады, сол себепті изошизомерлер әр түрлі реакция жағдайларын талап етеді.

Дәл осындай тізбектерді танитын бірақ оларды өзгеше үзетін ферменттерді гетерошизомерлер деп атайды. Мысалы: Sma I (GGG^CCC) және Xma I (G^GGCCC) рестриктазалары.

1 ші және 3 ші тип ферменттері күрделі суббірліктік құрылымға ие, және екі тип белсенділігі бар. – модификациялаушы(метилдеуші) және АТФ тәуелді эндонуклеазалық.

2ші тип ферменттері екі бөлек белоктан тұрады: рестрикциялық эндонуклеаза және модификациялайтын метилазалық,сол себепті гендік инженерияда тек 2ші тип ферменттері пайдаланылады. Оларға кофактор ретінде магний иондары қажет.

7.Днқ полимераза. Оның құрылыс ерекшеліктері және негізгі қасиеттері.

Репликация процесі күрделі және эффиктивті қызмет атқаратын репликациялық кешенді түзетін ферменттер арқылы жүзеге асады.Ол ферменттер:

ДНҚ –полимераза

ДНҚ –праймаза

ДНҚ –лигаза

ДНҚ- хеликаза

ДНҚ- топоизомераза

ДНҚ полимераза ДНҚ- ның полимерлену процесін катализдейтін фермент ДНҚ- полимераза.

Бактерияларда ДНҚ репликациясы бойынша негізгі жұмысты ДНҚ полимераза III атқарады, оның тағы 3'=>5‘ экзонуклеазалы белсенділігі де болады.

Эукариоттарда бес түрлі ДНҚ- полимераза болады. Соның ішінде α және β полимеразар ядролық ДНҚ- ның репликациясында,γ- полимераза митохондриялық ДНҚ репликациясында ,β және ε полимеразалар ДНҚ репарациясына қатысады.

Басты және қалып қоятын тізбектердің синтезін әртүрлі полимеразалар жүзеге асырады. Оказаки фрагменті синтезінің басталуына қажетті бос күйіндегі 3‘- ұшын РНҚ- праймер немесе РНҚ- ашытқы деп аталатын РНҚ- праймаза ферментінің көмегімен синтезделетін РНҚ- ның қысқа жіпшесімен (10 шақты нуклеотилтен тұратын) қамтамасыз етіледі.

ДНҚ- полимераза III ферментінің қатысуында бірден бірнеше Оказаки фрагменттерінің синтезделуіне мүмкіндік туғызады, ол кейінен матрицалық тізбекке комплементарлы жаңа ДНҚ тізбегін синтездейді.

Ғалымдар репликация процесі ферменттердің күшімен катализденуі тиіс деген болжам жасады. Сол себепті организмдерден ферменттерді іздеу басталды. Бұл жұмыс 1955 АҚШ та Корнберг басшығылымен табысты аяқталды. Ферментті ішек таяқшасыгың клеткаларынан бөліп оны ДНҚ полимераза деп атады. 500 мг ферментті алу үшін 100 кг клеткалар керек болды.бір клеткада ферменттің 400 молекуласы табылды. Оның молекулалық салмағы 109000, бір полипептидті тізбектен тұрады. Фермент сфералық түрде болады. Днқ полимераза бір тізбекті ДНҚ нің қатысуымен репликацияны өте жақсы жүргізеді. Егер қос спиральді ДНҚ ні алса, онда репликация жүрметіні байқалды. Ол үшін оны денатурациялау керек.

Прокариоттық ДНҚ-полимеразасы

Бактерияларда 5түрлі ДНҚ полимераза бар

• ДНҚ-полимераза I ДНҚ-ны қалпына келтіреді, 5'-3', и 3'-5'-экзонуклеазалық белсенділікке ие

• ДНҚ-полимераза II зақымдалған ДНҚ репликациясына қатысады. 5'-3'-тізбекті ұзартуға қабілетті және 3'-5'-экзонуклеазалы белсенділікке ие.

• ДНҚ-полимераза III бактериялардың негізгі полимеразасы. Ол да 3'-5'-экзонуклеазалы белсенділікке ие.

• ДНҚ-полимераза IV, ДНҚ-полимераза Yтуысына жатады ;

• ДНК-полимераза V, ДНК-полимераза туысына жатадыY, ДНҚның зақымдалған бөлімдерін өткізуге(пропуск)қатыссады

Эукариоттық ДНК-полимеразасы

Эукариоттарда ДНК-полимеразаның кем дегенде 15түрі бар

ДНК-полимераза α алдымен праймаза рөлін атқарады, ДНҚ праймерін синтезжейді, одан кейін қалыпты полимераза ретінде праймерге нуклеотидтерді жалғайды. Тізбектің ұзындыығы 20нуклеотидке жеткеннен кейін δ және ε полимеразалары транскрипцияға кіріседі;

ДНК-полимераза β ДНҚ-ны қалпына келтіруге қатысады;

Pol γ, митохондриялық ДНҚ-ның репликациясын жүзеге асырады

ДНК-полимераза δ —эукариоттардың негізгі полимеразасы. Жоғары өнімділікке ие және 3'-5'-экзонуклеазалық белсенді.

ДНК-полимераза ε, кей кезде ,3’-5’-моноспиральді синтездеу кезінде ДНК-полимераза δ –і алмастырады.

Y туысының η, ι, κ, Rev1 ДНК-полимеразалары ДНҚ-ның зақымданған бөлімдерін өткізуге (пропуск)қатысады.