«Окиснювально-відновлювальні ферменти (оксидоредуктази)»

Мета заняття: вивчити вплив різних факторів на активність оксидоредуктаз.

План заняття

1. Вивчити окислення формальдегіду дегідрогеназою молока.

2. Виявити вплив підвищеної температури на активність перок-сидази хріну.

3. Дослідити властивості рибофлавіну утворювати зворотню окислювально-відновлювальну систему.

4. Визначити роль поліфенолоксидази овочів у зміні їх забарв-лення.

Клас оксидоредуктаз включає ферменти, що беруть участь в окисленні та відновлюванні різних речовин. Окислення може здійснюватися декількома шляхами:

1 . АО + ½ О₂ АО₂ (приєднання кисню);

2 . АН₂ + В А + ВН₂ (відняття водню);

3 . А²⁺ А³⁺ + е^­0 (відняття електрона).

Ф ерментам цього класу належить важлива роль у диханні та бродінні. До оксидоредуктаз належать, зокрема, дегідрогенази, оксидази і пероксидази.

Дегідрогенази. Дегідрогенази каталізують окислення субстрату шляхом відняття від нього водню, тобто перенесення водню від донора (здатного до окислення субстрату) на відповідний акцептор. Акцептором може бути кисень або будь-яка речовина, що міститься у тканинах організму. У дослідах використовують штучний акцептор – метиленову синь (МС). Дегідрогеназа відбирає водень від субстрату і віддає його МС, яка відновлюється і перетворюється в безбарвну сполуку (МСН₂). Отже, обезбарвлення розчину може свідчити про дію дегідрогенази. Лейкоформа (МСН₂) легко окислюється киснем повітря, тому досліди проводять при відсутності повітря ( у пробірках Тунберга або звичайних пробірках під шаром рослинної олії).

Оксидази. Окислення різних субстратів за рахунок кисню повітря каталізують оксидази. До цієї групи ферментів належать поліфенолоксидаза і тирозиназа. Саме дією поліфенолоксидази пояснюється потемніння поверхні розрізаного яблука або картоплини. Цей фермент окислює полі- і монофеноли, дубильні речовини та інші органічні сполуки з утворенням темнозабарвлених продуктів. Тирозиназа бере участь в окисленні амінокислоти тирозину до темного пігменту меланіна («мелас» – від грецьк. чорний).

Пероксидаза. У лабораторіях широко використовують метод визначення активності пероксидази, в основу якого покладено окислення пірогалолу в присутності перекису водню до пурпурогаліну, що утворює в розчині червоно-бурий осад.

1. Окислення формальдегіду дегідрогеназою молока

У молоці містяться дегідрогенази, що потрапляють із молочної залози та з мікрофлори молока. Альдегіддегідрогеназа окислює формальдегід до мурашиної кислоти.

Об’єкт дослідження: Молоко (джерело ферменту).

Обладнання і посуд: 1. Штатив із пробірками;

2. Водяна баня на 40^оС;

3. Годинник або секундомір.

Реактиви: 1.Формальдегід, 0,4 %-й розчин;

2. Метиленова синь (МС), 0,001 %-й розчин;

3. Трихлороцтова кислота, 20 %-й розчин.

Техніка виконання роботи

В одну пробірку вливають 5 мл кип’яченого молока, у другу – 5 мл свіжого. В обидві пробірки додають 0,5 мл розчину формальдегіду та 3 краплі розчину МС. Вміст струшують і пробірки розташовують у водяній бані (40⁰С). Фіксують час, необхідний для знебарвлення МС. Активність дегідрогенази виражають у хвилинах, необхідних для знебарвлення МС. Одержані результати записують і роблять висновок.

Одержані результати записують і пояснюють.

У всіх дослідах з дегідрогеназами використовували ТХО або високу температуру для інактивації ферменту. Ці фактори незворотне денатурують ферментний білок, тому при послідуючій інкубації в оптимальних умовах активність ферментів не виявлялася (контрольний варіант дослідів).

2. Вплив температури на активність пероксидази хрону

Об’єкт дослідження: Екстракт хрону.

Обладнання і посуд: 1. Штатив із пробірками;

2. Палички скляні;

3. Піпетки;

4. Термостат.

Реактиви: 1. Пірогалол, 1 %-й розчин;

2. Перекис водню, 2 %-й розчин.

Техніка виконання роботи

Щоб визначити вплив температури на активність пероксидази, проводять досліди при 0...4^оС (холодильник) та 37^оС (термостат).

В пробірку вносять 1 мл розчину перекису водню й 1,5 мл розчину пірогалолу. Вміст пробірки доводять до заданої температури (нагріваючи або охолоджуючи), а потім додають 1,5 мл екстракту хрону, заздалегідь термостатованого при тій самій температурі в окремій пробірці. Вміст пробірки постійно перемішують скляною паличкою. Заміряють час до появи червоно-бурого осаду. Активність пероксидази виражають у секундах, необхідних для появи забарвлення.

3. Дослідження властивості рибофлавіну утворювати зворотню окислювально-відновлювальну систему

Об’єкт дослідження: Рибофлавін.

Обладнання і посуд: 1. Штатив із пробірками;

2. Гумові або коркові пробки.

Реактиви: 1. Рибофлавін, 0,015 %-й розчин;

2. НСl, концентрована;

3. Цинк, шматочки.

Техніка виконання роботи

У пробірку наливають 1 мл розчину рибофлавіну, потім додають 5 крапель НСl та шматочок цинку. Закорковують і залишають на 10...20 хв. спостерігають зникнення жовтого кольору рибофлавіну. Спочатку під впливом виділяющогося водню колір розчину поступово змінюється: спочатку з жовтого на зелений, а потім на рожевий і поступово обезбарвлюється (рибофлавін відновлений). Через 10...20 хвилин спостерігають появу жовтого кольору розчину (рибофлавін окислений).

4. Визначення ролі поліфенолоксидази в зміні забарвлення овочів та впливу на них гіпосульфіту натрію

Під впливом цього ферменту з циклічних амінокислот, що входять до складу білків картоплі, утворюються темнозабарвлені сполуки, внаслідок чого він темніє.

Об’єкт дослідження: Сира картопля.

Обладнання і посуд: Парцелянові ступки з товкачиками.

Реактиви: Гіпосульфіт натрію, 0,1 н розчин.

Техніка виконання роботи

У дві ступки кладуть по шматочку картоплі (1...2 г) і розтирають до однородної маси. Потім в першу ступку додають 2...3 мл розчину гіпосульфіту Na та перемішують. Сполуки залишають на повітрі на 15...20 хв., потім фіксують зміну забарвлення у кожній ступці.

Контрольні запитання

1. Яка роль ферментів в організмі?

2. Розповідайте про будову ферментів й їхніх активних центрів.

3. Якими властивостями володіють ферменти?

4. Як впливають на активність ферментів фізичні й хімічні фактори?

5. Чим обумовлена специфічність дії ферментів? Види специфічності.

6. Які номенклатура й класифікація ферментів?

7. Охарактеризуйте різні класи ферментів.

8. Які процеси харчових виробництв засновані на дії ферментів?

9. Які ферменти застосовуються в консервній промисловості?

10. Які ферменти застосовуються в м‘ясопереробній промисловості?

11. Які ферменти застосовуються в крохмале-патоковій промисловості?

12. Яка роль біологічного окислювання для процесів життєдіяльності організму?

13. Які розходження біологічного окислювання й окислювання в неживій природі?

14. Назвіть групи ферментів, що приймають участь у біологічному окислюванні.

15. Як побудовані анаеробні і аеробні дегідрогенази?

16. Розповісти про ролі гемінових ферментів у біологічному окислюванні.

17. Як здійснюється транспорт електронів і протонів у біологічному окислюванні?

18. Які речовини є кінцевими продуктами біологічного окислювання?

19. Чим відрізняються окислені форми НАД і ФАД від відновлених?

20. При підвищенні функції щитовидної залози різко збільшується утворення тепла, підвищується температура тіла. Які біохімічні процеси обумовлюють це явище?