Тонкое строение хромосом и генов, организация генома

1. Хромосомы вирусов и прокариотов

2. Молекулярная структура хромосом эукариотов

3. Число молекул ДНК в хромосомах эукариотов

4. Организация генома

5. Тонкое строение гена

6. Цис-транс-тест

7. Мобильные элементы генома

Несмотря на то, что хромосомы изучаются уже на протяжении целого столетия, проникнуть в их тонкое строение удалось только в последние годы, благодаря разработке и применению электронномикроскопических, авторадиографических и цитохимических методов.

Хромосомы вирусов и прокариотов. У ДНК- содержащих вирусов, бактерий, сине-зелёных водорослей, а также в самореплицирующихся органеллах клеток у эукариотов, т.е. в пластидах, митохондриях и т.д. хромосома представляет собой голую двуспиральную молекулу ДНК. Молекула эта у некоторых форм линейна, но у большинства концы её соединены так, что она образует кольцо, которое закручено в шпильку, и хромосома сверхспирализована.

Репликация этих хромосом – молекул ДНК начинается с определённой точки и прогрессирует, пока не закончится репликация всей хромосомы. Длина молекул ДНК, служащих хромосомами вирусов, прокариотов и клеточных органелл, составляет от 0,4 до 1 мк у мелких вирусов и кинетопластов, 5-100 мк у других вирусов, пластид и митохондрий и достигает 1000-2000 мк у бактерий. У большинства РНК-содержащих вирусов хромосома представлена голой однонитевой молекулой РНК, которая подобно однонитевой ДНК превращается в заражённой клетке в репликативную двунитевую молекулу. Однако известны и вирусы с двунитевой молекулой РНК. У бактерий геном организован в компактное тело, называемое нуклеотидом.

В отличие от прокариотов в хромосомах эукариотов молекулы ДНК имеют гигантские размеры, длина их может достигать нескольких сантиметров. У эукариотов хромосома состоит из множества репликонов, т.е. в хромосоме есть множество определённых точек, с которых начинается репликация ДНК. Обычно возле каждой такой точки инициации образуются две вилки репликации и синтез новой нити ДНК идёт в обе стороны до концов данного репликона. В эухроматиновых учатках хромосом репликация всех репликанов происходит более или менее одновременно, гетерохроматиновые же участки реплицируются с опозданием. Длина репликона у эукариотов колеблется от 10 до 150 микронов, что соответствует приблизительно 20-300 тысячам пар нуклеотидов. В хромосоме бывает от 200-300 до более 1000 репликонов. В геноме дрозофилы насчитывается, по-видимому, свыше 1000 репликонов, в геноме человека их около 37000.

Молекулярная структура хромосом эукариотов. Возникает вопрос: каким образом хромосомная ДНК упаковывается в интерфазную и митотическую хромосому? В последнее десятилетие выяснено, что эукариотические хромосомы имеют несколько уровней организации, соот­ветствующих уровням компактизации ДНК. От этой организации в значительной мере зависят и другие элементар­ные генетические процессы. Комплекс ДНК с белками, имеющий специфическую структурную организацию, полу­чил название хроматина, которое ранее применялось для обозначения вещества хромосом. Существенные элементы хроматина — нуклеосомы, дисковидные частицы 10 нм в диаметре. Нуклеосомы образуются в резуль­тате взаимодействия четырех классов основных белков — гистонов Н2А, Н2В, НЗ и Н4, причем молекулы двух последних гистонов могут in vitro формировать тетрамер, к которому присоединяются два димера — Н2А и Н2В. Участок двойной спирали ДНК образует 1 ³/4 оборота во­круг так называемой сердцевины нуклеосомы. Этот уча­сток ДНК, непосредственно связанный с сердцевиной, имеет постоянную длину, равную 140 п.н. В то же время межнуклеосомные линкеры (связки) варьируют по длине от 15 до 100 п.н. и даже больше. Таким образом, закручивание ДНК вокруг нуклеосомы уменьшает ее длину в семь раз. Еще один тип гистонов — Н1 — непосред­ственно в формировании нуклеосом не участвует. Он при­креплен к линкеру обоими своими концами и стабилизирует связь нуклеосом, образующих спираль более высокого порядка — соленоид, диаметр которого 25—50 нм. Кон­денсация ДНК в структуре соленоида дополнительно (к нуклеосомному уровню) уменьшает ее длину в шесть раз. В интерфазных хромосомах путем еще одного цикла конденсации соленоиды образуют полые трубочки диаметром 200 нм, что уменьшает длину ДНК еще в 18 раз.

В метафазе вследствие дальнейшей конденсации возникает большая образованная дезоксинуклеопротеидом спираль диаметром около 600 нм. В результате строго упорядочен­ной иерархии спиралей, в основе которой лежит нуклеосома, в митозе и мейозе хромосомы эукариот совершают цикл компактизации — декомпактизации. Следствие этого цикла — укорочение метафазных хромосом по сравнению с размерами заключенной в них молекулы ДНК в 10³—10⁴ раз. По-видимому, цикл компактизации — декомпактиза­ции регулируется белками хроматина негистонового типа. Возможно, что некоторые из них выполняют и структур­ную роль, образуя элементы каркаса метафазных хромосом.

Число молекул ДНК в хромосомах эукариот. Существуют три гипотезы о способах упаковки ДНК в хромосомах эукариот. Согласно первой, по всей длине хромосомы тянется одна-единственная непре­рывная молекула ДНК (гипотеза однонитчатой, или унинемной, хромосомы). По второй гипотезе, хромосома (хроматида в G₂) состоит из двух (или более) субъединиц — полухроматид, субхроматид, которые могут идти парал­лельно или быть взаимно закрученными. Каждая субхроматида содержит молекулу (лы) ДНК. Это гипотеза мно­гонитчатой, или полинемной, в простейшем случае — бинемной хромосомы. Наконец, некоторые авторы полагали, что ДНК в эукариотических хромосомах периодически прерывается связками иной химической природы, напри­мер белковой или фосфолипидной. Последнее предполо­жение не нашло экспериментального подтверждения и в настоящее время в основном оставлено.

Что касается моделей многонитчатой хромосомы, то они основаны преимущественно на данных цитологов, наблюдавших «субхроматиды» в живых клетках или после их специальной фиксации. Однако теперь ясно, что с по­мощью световой и электронной микроскопии строго обо­сновать эти модели невозможно.

На сегодняшний день по совокупности фактов пред­почтение следует отдать гипотезе «одна ДНК: одна хро­мосома». В пользу ее свидетельствуют: а) данные гене­тики о линейном расположении генов в хромосомах; б) наличие уникальных нуклеотидных последова­тельностей в геномах эукариот; в) распределение ³Н-тимидиновой метки в I и II циклах репликации, полностью соответствующее модели Уотсона и Крика; г) данные вискозиметрического анализа лизатов клеток культуры ткани дрозофилы с нормальным и перестроенным хромосомными наборами, показывающие, что молекулярная масса самых крупных частиц в лизате (после его депротеинизации) сравнима с молекулярной массой ДНК самых крупных хромосом данного кариотипа; д) данные по контролируе­мому растяжению политенных хромосом хирономуса, указывающие на то, что их разрывы начинаются только тогда, когда растянутая с помощью микроманипу­лятора хромосома достигает длины упакованной в ней ДНК; е) данные радиационной цитогенетики, доказываю­щие, что перестройки хромосом, ранее считавшиеся субхроматиднымы, в действительности являются хроматидными аберрациями, имеющими своеобразную конфигурацию при облучении клеток в профазе митоза. Если верна модель однонитчатой хромосомы, то длина ДНК, заключенной в эукариотических хромосомах, может достигать нескольких сантиметров.

В беспорядочном сплетении хроматид интерфазного ядра довольно трудно обнаружить активные участки. Однако в некоторых участках удаётся видеть ответвляющиеся от хроматид тонкие нити мРНК. Особенно хорошо различимы активные участки в хромосомах ооцитах земноводных, в политенных хромосомах слюнных желез дрозофилы и других двукрылых насекомых, а также в ядрышковом организаторе. В ооцитах амфибий, рыб, птиц и рептилий хромосомы сильно вытянуты и образуют симметричные петли (хромосомы типа «ламповых щеток»). Как показали электронно-микроскопические исследования петли состоят из деспирализованного участка ДНК. Вдоль петли расположены молекулы РНК-полимеразы и от каждой из них отходит нить иРНК. В слюнных железах большинство генов репрессировано. Активация гена ведёт к разбуханию соответствующего хромомера. Такие вздувшиеся хромомеры получили название пуффов. Пуфф образован петлями деспирализованных нитей ДНК хромомеров, подобно петлям «ламповых щеток».

Особый вид активного хроматина представлен ядрашками, хорошо видимыми в большинстве интерфазных фдер, ДНК в этом участке хромосом (ядрышковом оргазиторе) состоит из многократных повторов генов рРНК, число таких повторов может составлять у разных объектов от сотен до тысяч.

В некоторых клетках, в которых происходит интенсивный синтез белка и поэтому нужно большое количество рибосом, происходит амплификация генов рРНК. При репликации генов рРНК часть этих генов выходит из хромосомы в ядерный сок, располагается вблизи ядерной мембраны и продолжает там автономно реплицироваться по способу «катящегося обруча». Затем в сотнях, тысячах или даже миллионах сформированных таким образом добавочных ядрышек происходит транскрипция, и огромное количество молекул рРНК поступает из ядра в цитоплазму и используется при образовании рибосом.

Другой способ компесаторного увеличения числа генов рРНК, называется магнификацией. Существенно отличается от амплификации тем, что: 1. происходит не только в ооцитах, но и во всех клетках зародыша; 2. гены рРНК встраиваются в хромосомы и стойко сохраняются в ряду клеточных поколений; 3. магнификации могут подвергаться не только гены, кодирующие рРНК, но и гены, кодирующие белки.

Организация генома. Главная количественная особенность генетического материала эукариот — наличие избыточной ДНК. Этот факт легко выявляется при анализе отношения числа генов к количеству ДНК в геноме бактерий и млекопитающих. Если средний размер гена бактерий 1500 пар нуклеотидов (п.н.), а длина кольцевой молекулы ДНК хромосомы Е.соli и В.subtilis составляет около 1,1 мкм, то в такой хромо­соме могут разместиться около 3000 генов. Примерно такое число генов было экспериментально определено у бактерий по числу типов иРНК. Если это число умножить на средний размер гена, то получится, что около 95% генома бактерий состоит из кодирующих (генных) последовательностей. Остальные 5%, по-видимому, заняты регуляторными элементами. Иная картина наблюдается у эукариотических организмов. Например, у человека насчитывают приблизительно 5∙10⁴ генов (имеется в виду только сум­марная длина кодирующих участков ДНК — экзонов). В то же время размер генома человека 3∙10⁹ п.н. Это означает, что кодирующая часть его генома составляет всего 15—20% от тотальной ДНК. Существует значитель­ное число видов, геном которых в десятки раз больше ге­нома человека, например некоторые рыбы, хвостатые амфибии, лилейные. Избыточная ДНК характерна для всех эукариот. В этой связи необходимо подчеркнуть не­однозначность терминов генотип и геном. Под генотипом следует понимать совокупность генов, имеющих фенотипическое проявление, тогда как понятие генома обозначает количество ДНК, находящееся в гаплоидном наборе хро­мосом данного вида.

В конце 60-х годов XX века работами американских ученых Р.Бриттена, Э.Дэвидсона и других была открыта фунда­ментальная особенность молекулярной структуры генома эукариот — нуклеотидные последовательности разной степени повторяемости. Это открытие было сделано с по­мощью молекулярно-биологического метода изучения кинетики ренатурации денатурированной ДНК. Различают следующие фракции в геноме эукариот.

1.Уникальные, т.е. последовательности, представ­ленные в одном экземпляре.

2.Промежуточные, или среднечастотные, повторы — последовательности, повторяющиеся десятки и сотни раз.

3. Высокочастотные повторы, число которых достигает 10⁶ (на геном). Повторы образуют так называемые семейства, под которыми понимают совокупность последовательностей, полностью или по большей части гомологичных друг другу.

У вирусов их нуклеиновая кислота состоит целиком из структурных генов. Хромосома РНК-содержащего вируса длиной 1200 нуклеотидов содержит один структурный ген. У других мелких вирусов ~ 3 тыс. нуклеотидов, т.е. три гена среднего размера. ДНК сложных вирусов содержит более 200 тыс. пар нуклеотидов и от десятков до сотен структурных генов. В гораздо более крупном бактериальном геноме молекула ДНК состоит из нескольких миллионов пар оснований, большинство генов уникальны (за исключением генов рРНК и тРНК).

У животных больше половины гаплоидного генома занимают, как правило, участки ДНК, представленные там лишь по одному разу. У высших растений доля уникальных генов составляет 20-30%. По-видимому, к числу таких уникальных участков относится большинство структурных генов, кодирующих белки (кроме гистонов).

К повторам средней частоты относятся гены рибосомальной РНК, транспортной РНК и гистонов. Число копий в гаплоидном геноме колеблется от нескольких сот до нескольких тысяч. Общая доля всех видов повторов средней многократности составляет у эукариотов от ¹/₁₀ до ¼ генома.

Нередко из-за существенных различий в нуклеотидном составе высокочастотных повторов и остальной ДНК пер­вые образуют при центрифугировании в градиенте плот­ности хлористого цезия так называемые сателлитные пики, которые имеют большую или меньшую плавучую плотность, чем остальная ДНК. Эта фракция генома пред­ставлена небольшим (10—15) числом семейств коротких (5—12 п.н.) повторов, образующих протяженные блоки. Внутри блоков группы повторов отдельных семейств могут чередоваться друг с другом, так что сателлитная ДНК имеет как бы лоскутную структуру. Гибридизация фракций высокочастотных последовательностей с ДНК непосред­ственно на препаратах хромосом позволила установить, что эта фракция генома локализована в районах конститутивного гетерохроматина, чаще всего прицентромерного или теломерного. Еще в 30-х годах XX столетия было показано, что в генетическом отношении эти районы инертны, т.е. не содержат генов. В действительности столь малые после­довательности, составляющие сателлитную ДНК, не могут кодировать ничего, кроме олигопептидов. Более того, гете­рохроматические районы не транскрибируются. Таким образом, в случае высокочастотных последовательностей ДНК обнаруживается тождество молекулярной организации и генетических свойств хромосомной ДНК эукариот. Следует отметить, что эта фракция у огромного большинства видов занимает не более 10% генома.

Тонкое строение генома. Представление о генах, основанное на данных классичес кой генетики и прежде всего на работах школы Т.Моргана, сформулировались к концу 30-х годов XX века. В основу определения гена как единицы наследственности были положены три критерия: функция, мутация, рекомбинация. В дальнейшем стало ясно, что лишь один из перечисленных критериев, в основном, соответствует определению гена: ген является единицей функции, кодирующей молекулы полипептида либо нуклеиновой кислоты (рРНК и тРНК). Что же касается определения гена как единицы рекомбинации и мутации, то оно пересмотрено, была установлена делимость гена на части в результате кроссинговера, а затем показано, что единица структуры не ген, а лишь одиночная пара нуклеотидов, способная к мутации и рекомбинации.

Первые экспериментальные доказательства делимости гена были получены в опытах с D.melanogaster и связаны с открытием явлений ступенчатого аллеломорфизма, и псевдоаллелизма. Ступенчатый аллелизм был обнаружен в конце 20-х годов советскими генетиками А.С.Серебровским и его учениками. Авторы изучали мутации гена scute-sc, sc₂ и т.д., вызывающие редукцию щетинок на разных участках тела дрозофилы. При скрещивании гомозиготных по аллелям гена scute особей, например у гетерозигот чаще всего отсутствовали только те щетинки, которых не было у обеих гомозиготных особей. Если аллель SC₁ приводит к редукции щетинок в частях тела, условно обозначаемых А₁В₁С₁, а аллель SC₂ в частях - B₁C₁D₁, то у гетерозигот не было щетинок В и С, а А и D развивались нормально. Авторы приходят к заключению, что функциональной единицей может быть не вся аллель, а отдельные её части. Явление ступенчатого аллелизма было истолковано как свидетельство дробимости, сложности структурного гена.

Цис-транс-тест. Дальнейшее развитие исследований структуры гена с введением Э.Льюисом и С.Бензером в качестве критерия аллелизма комплементационного или цис-транс-теста. Напомним, что аллелями называют формы одного и того же гена, возникающие в результате его мутационной изменчивости. Аллели дикого типа, как правило, доминантные, мутантные аллели обычно рецессивны. Гетероаллели - различаются по типу и (или) локализации, изоаллели (когда в гомологичных точках содержатся одинаковые, но противоположно ориентированные в отношении цепей ДНК пары нуклеотидов), гомоаллели (когда в гомологичных точках аллелей в той же ориентации расположены одинаковые пары нуклеотидов).

Для того, чтобы две мутации, а₁ и а₂ могли быть исследованы с помощью цис-транс-теста они должны оказаться в одной клетке в одной, из двух возможных конфигураций по отношению друг к другу. Организм или клетку, несущую обе мутации в цис-положении, т.е. в одной хромосоме называют цис-гетерозиготой. Расположение этих мутаций в разных хромосомах одной пары (у эукариот) означает, что они находятся в транс-конфигурации в составе транс-гетерозиготы. Поскольку речь идёт о рецессивных мутациях, цис-гетерозигота будет иметь дикий фенотип, независимо от того, находятся ли мутации в разных аллелях одного гена, или разных генах. В транс-гетерозиготе результат будет различен. Если мутации расположены в разных генах, фенотип будет диким, если же обе мутации затрагивают одну единицу функции, возникает гомозигота с мутантным фенотипом, так как в гомологичных хромосомах мутантны одинаковые гены.

Мобильные элементы генома. В 1948 г. американская исследовательница Мак-Клинток открыла у кукурузы гены перемещающиеся из одного участка хромосомы в другой и назвала феномен транспозицией, а сами гены контролириующими элементами (КЭ). 1.Эти элементы могут перемещаться из одного сайта в другой; 2. их встраивание в данный район влияет на активность генов расположенных рядом; 3. утрата КЭ в данном локусе превращает прежде мутабильный локус в стабильный; 4. в сайтах, в которых присутствуют КЭ, могут возникать делеции, транслокации, транспозиции, инверсии, а также разрывы хромосом. В 1983 г. за открытие мобильных генетических элементов Нобелевская премия была присуждена Барбаре Мак-Клинток.

Наличие мобильных элементов в геномах имеет разнообразные последствия:

1. Перемещения и внедрение мобильных элементов в гены может вызывать мутации;

2. Изменение состояния активности генов;

3. Формирование хромосомных перестроек;

4. Формирование теломер.

5. Участие в горизонтальном переносе генов;

6. Транспозоны на основе Р-элемента используют для трансформации у эукариот, клонирования генов, поиска энхансеров и т.д.

У прокариот существуют три типа мобильных элементов – IS-элементы (инсерции), транспозоны, и некоторые бактериофаги. IS-элементы встраиваются в любой участок ДНК, часто вызывают мутации, разрушая кодирующие или регуляторные последовательности, влияют на экспрессию соседних генов. Бактериофаг может вызывать мутации в результате встраивания.

Вопросы

1. Каковы различия хромосом прокариотов и эукариотов?

2. Какова роль гистонов в организации хромосом?

3. Что такое нуклеосомы?

4. Каково число молекул ДНК в хромосомах эукариотов?

5. Какие виды активного хроматина Вам известны?

6. В чём заключается количественная особенность генома эукариотов?

7. Какие фракции различают в геноме эукариотов? Опишите их.

8. Каково современное представление о генах?

9. Что такое цис-транс-тест?

10.Какие свойства имеют мобильные элементы генома?

11.Каково функциональное значение мобильных элементов?

12. Какие типы мобильных элементов у прокариотов существуют?

ЛЕКЦИЯ 11