Молекулярные механизмы мутаций и рекомбинаций

1. Типы повреждений нуклеиновых кислот, проявляющиеся в виде мутаций.

2. Молекудярные механизмы действия мутагенов.

3. Репарация повреждений ДНК.

4. Молекулярный механизм коньюгации хромосом.

5. Молекулярные механизмы кроссинговера.

6. Мобильные элементы генома.

Анализ молекулярных механизмов наследственной изменчивости стал возможен только после того, как многие важ­ные аспекты этого универсального био­логического явления были выяснены разнообразными гибридологическими и цитогенетическими исследованиями, главные результаты которых были рас­смотрены в предыдущих лекциях. Но хо­тя изучение на молекулярном уровне обеих основных категорий наследственных изменений — мутаций и рекомбинаций — началось относительно недав­но, в этой области к настоящему времени достигнуты большие успехи, по­лучены сведения, касающиеся непосред­ственно не только закономерностей наследственной изменчивости, а имеющие и более широкое значение, так как они углубили существовавшие ранее представления о тонком строении и функционировании генетического аппарата и открыли новые подходы к управлению наследственностью живых существ.

Так как носителем генетической ин­формации являются молекулы нукле­иновых кислот, следовало ожидать, что генные и сегментные мутации обязаны изменениям этих молекул. Предполо­жение это полностью подтвердилось многочисленными экспериментальными работами, имевшими целью выяснение молекулярного механизма мутаций. Огромное большинство таких исследо­ваний было выполнено путем изучения мутаций, искусственно вызванными раз­ными физическими и химическими факторами. Этот подход определяется тем, что применение мутагенов позволяет получать мутации с гораздо большей частотой, чем они возникают спонтан­но, т.е. без искусственного воздействия, а также тем, что использование хорошо охарактеризованного в физическом или химическом отношении фактора дает возможность сравнить его действие на геном клетки или вируса с действием того же фактора непосредственно на молекулы нуклеиновой кислоты в про­бирке, что облегчает интерпретацию результатов опыта. Быстрота размножения бактерий и вирусов, возможность получать у них чрезвычайно мно­гочисленное потомство и относительная простота организации их хромосом по­служили причиной того, что преобладающая доля работ, посвященных изучению молекулярных механизмов мутаций, была выполнена на этих объектах. Заключения, вытекающие из этих работ, сопоставляются с не столь полными и часто менее точными данными аналогичных исследований, проводи­мых на эукариотах, и помогают их ис­толкованию. Существующие в настоящее время представления о молекулярных механизмах спонтанных мутаций основаны главным образом на экстра­поляции выводов, сделанных из опытов по искусственному вызыванию мутаций.

Типы повреждений нуклеиновых кислот, проявляющихся в виде мутаций. Повреждения молекул ДНК (и молекул РНК, представляющих геном РНК-содержащих вирусов), возникающие спон­танно или вызываемые разными мутагенами и могущие проявляться как мутации, относятся к следующим основ­ным типам: разрывы углеводно-фосфат­ного остова молекулы, вставки, выпа­дения или химические изменения отдельных нуклеотидов, образование сшивок азотистых оснований в пределах одной нити или между двумя нитями молекулы, возникновение сшивок моле­кул нуклеиновых кислот с белками. Все эти повреждения молекул геномных нуклеиновых кислот не обязательно реализуются в виде мутаций: они могут репарироваться (исправляться) особыми репарирующими ферментами, восстанавливающими нормальное стро­ение молекулы и тогда мутация не воз­никает (эти репаративные процессы бу­дут рассмотрены ниже). Разрывы углеводно-фосфатного ске­лета молекул нуклеиновых кислот (без воссоединения оборванных концов или с их воссоединением в новых сочетани­ях) могут приводить к возникновению различных перестроек хромосом — не­хваток, делеций, дупликаций, инвер­сий, транслокаций, транспозиций.

Вставки или выпадения отдельных нуклеотидов приводят к искажению транскрипции и, соответственно, строе­ния синтезируемых полипептидов. Сте­пень фенотипических изменений, обя­занных мутациям этого типа, получив­ших название сдвига рамки считывания, зависит от функций, выполняемых в организме затронутым мутацией белком, а также от того, в каком месте ге­на произошла вставка или выпадение нуклеотида. Как правило, если вставка или выпадение нуклеотида имели мес­то в участке гена вблизи промотора, т.е. недалеко от точки, с которой начи­нается транскрипция этого гена, то полипептид, кодируемый им, оказывается испорченным на большом протяжении, и соответствующий белок полностью или в очень большой степени инактивируется. Кроме того, на степень фенотипического выражения мутаций сдвига рамки считывания влияет то, какая часть полипептида повреждена: некото­рые участки белковой молекулы (напри­мер, активные центры ферментов) го­раздо важнее для ее нормального функ­ционирования, чем другие. Но если в пределах гена возникнет не одна, а две мутации сдвига рамки считывания (причем одна из них пред­ставляет вставку, а другая — выпадение нуклеотида и они будут располо­жены по соседству), то они окажутся супрессорами по отношению друг к дру­гу, так как считывание генетической информации при транскрипции, иска­жаемое каждой мутацией порознь, в значительной мере нормализуется соче­танием двух таких мутаций.

Химические изменения азотистых оснований нуклеиновых кислот или сра­зу проявляются в виде генных мутаций, или приводят к появлению генных му­таций в ходе последующей репликации поврежденной молекулы нуклеиновой кислоты вследствие включения в дочер­нюю молекулу нуклеотида с неверным азотистым основанием. При этом пуриновое основание заменяется другим пуриновым или пиримидиновое— другим пиримидиновым (такие замены назы­ваются транзициями) либо пуриновое основание заменяется пиримидиновым или пиримидиновое — пуриновым (та­кие замены называются трансверсиями). Эти замены азотистых оснований молекул нуклеиновой кислоты обуслов­ливают два типа нарушений нуклеотидного состава кодонов, а следовательно, и направляемого ими синтеза белков: либо возникают так называемые нон­сенс («бессмысленные») мутации, в ре­зультате которых измененный кодон во­обще не определяет включение какой-нибудь аминокислоты в синтезируемый белок, либо появляются так называемые миссенс («искажающие смысл») мута­ции, при которых измененный кодон оп­ределяет включение в синтезируемый белок неверной аминокислоты вместо той, какая нормально должна была бы занимать соответствующее место в полипептидной цепи.

Нонсенс-мутации обязаны таким транзициям и трансверсиям, вследствие которых кодон матричной РНК, нор­мально кодирующий включение в рас­тущую полипептидную цепь какой-ни­будь определенной аминокислоты, пре­вращается в терминирующий кодон УАГ, УАА или УГА, обрывающий даль­нейший синтез полнпептидной цепи, так что она оказывается укороченной. Так, например, если кодон ААГ матричной РНК, кодирующий включение в полипептид лизина, превратится вследствие транзиции А→У в кодон УАГ, то синтез полипептидной цепи не сможет завер­шиться — он дойдет только до того мес­та, где должен был находиться этот ли­зин, после чего прекратится.

Нонсенс-мутации обычно очень силь­но повреждают соответствующие белки и поэтому часто бывают летальными. Кроме того, нонсенс-мутации могут сни­жать синтетическую активность всех позже считываемых структурных генов того же оперона; активность же генов, лежащих между оператором и мутантным геном, т.е. считываемых ранее него, при этом не затрагивается.

Полярный эффект нонсенс-мутаций объясняется следующим образом. Нор­мально вся матричная РНК густо по­крыта рибосомами, защищающими ее от действия имеющихся в клетке нуклеаз. Рибосомы продвигаются по мРНК и, дойдя до терминирующего кодона, освобождает синтезированный полипептид и отрываются от мРНК, чтобы сразу же затем присоединиться к ней у начального кодона следующего гена. При этом не занятым рибосомами ос­тается лишь очень маленький участок мРНК между терминирующим кодоном одного гена и начальным кодоном дру­гого гена. Когда же в результате нон­сенс-мутации трансляция гена закан­чивается преждевременно, то оказыва­ется свободным от рибосом и не защи­щенным от нуклеаз гораздо более протяженный кусок мРНК от точки, где произошла нонсенс-мутация, до терми­нирующего кодона претерпевшего эту мутацию гена. Вероятность разрыва нуклеазами этого куска до­вольно высока и в случае такого раз­рыва вся часть мРНК, лежащая пра­вее него, теряется и заключенная в ней генетическая информация не трансли­руется. Поэтому степень проявления полярности тем сильнее, чем ближе находится нонсенс-мутация к начальному (примыкающему к оператору) участку затронутого ею гена. Из-за этого раз­личные нонсенс-мутации в разной мере снижают активность генов, расположен­ных правее мутантного.

В зависимости от того, какой из тер­минирующих кодонов возникает при нонсенс-мутации, они получили разные условные названия: амбер-мутации (ко-дон УАГ), охра-мутации (кодон УАА) и опал-мутации (кодон УГА).

Миссенс-мутации встречаются значи­тельно чаще нонсенс-мутаций. Это и по­нятно — ведь гораздо вероятнее, что замена основания в кодоне превратит его не в один из трех терминирующих кодонов, а в какой-нибудь из десятков кодонов, определяющих включение дру­гих аминокислот в полипептидную цепь.

Поскольку всякая миссенс-мутация приводит к замене только одной ами­нокислоты в синтезируемой полипептидной цепи, такие мутации обычно менее глубоко изменяют свойства белка, чем нонсенс-мутации, но многое зависит от того, какая именно произошла замена. Так, замена валина на лейцин, глицина на аланин или тирозина на фенилаланин мало отражается на функциях полипептида, поскольку в каждой из этих пар аминокислоты, химически сходны между собой; это так называемые кон­сервативные замены. Другие замены отдельных аминокислот могут значительно сильнее повреждать полипептид. Например, замены лейцина на аргинин или аспарагиновой кислоты на валин изменяют суммарный заряд полипептидной цепи. Замена цистеина (единствен­ной аминокислоты, содержащей серу) другими аминокислотами часто нару­шает третичную или четвертичную структуру белковой молекулы, в значительной мере обусловливаемую дисульфидными связями между цистеинами.

Особенно сильные фенотипические изменения могут вызываться миссенс-мутациями, затрагивающими в генах транспортных РНК участки, кодирующие антикодоны последних. Образую­щиеся в результате подобных мутаций измененные тРНК включат ошибочную аминокислоту не в одну точку одного какого-нибудь белка, а во множество точек всех белков, синтезируемых при участии этой тРНК. Например, транспортная РНК, содержащая антикодон УГГ, присоединяет к себе аминокислоту триптофан и обеспечивает включение триптофана в нужные места синтези­руемой полипептидной цепи. Но если вследствие миссенс-мутации соответствующего гена антикодон этой тРНК^три превратится вУГЦ, то она будет вклю­чать прицепленный к ней триптофан не в те точки полипептидной цепи, где это предусмотрено информацией, заклю­ченной в мРНК, а в точки, где должны были бы находиться цистеины, конку­рируя при этом с тРНК^цис. Наиболее глубокие повреждения белков вызывают миссенс-мутации, изменяющие кодоны тРНК тех двух аминокислот (метионина и триптофана), код которых не вырожден, т.е. которые переносятся в рибосомы только одним сортом тРНК каждая. В этих случаях все, синтезируемые белки будут испорчены, так как будут полностью лишены соответствен­но метионина или триптофана. Вклю­чение в белок других аминокислот, кодируемых двумя или более разными триплетами, менее нарушается подоб­ными миссенс-мутациями, изменяющи­ми антикодоны тРНК, так как мутантные тРНК будут конкурировать при трансляции с изоакцепторными тРНК, способными включать данную амино­кислоту в правильные места синтезиру­емого полипептида. Разумеется, очень сильно нарушают структуру белков так­же и нонсенс-мутации, изменяющие, антикодоны транспортных РНК, образуемые при этом тРНК, антикодоны которых заменены терминирующими триплетами УАГ, УАА или УГА, теряют способность, включать присоединенную к ним аминокислоту в растущую полипептидную цепь.

Замена основания в терминирующем триплете, разделяющем два соседних гена, может превратить его в кодон, оп­ределяющий включение в полипептид какой-нибудь аминокислоты. Тогда два полипептида, кодируемых этими, генами, окажутся связанными в одну длиную полипептпдиую цепь, что неизбежно исказит нормальное функционирование этих полипептидов. Не всякие замены оснований в моле­кулах геномных нуклеиновых кислот проявляются в виде мутаций. Из-за вы­рожденности генетического кода все аминокислоты, кроме метионина и триптофана, кодируются двумя или несколь­кими кодонами каждая. Иногда замена основания может привести к превраще­нию кодона в другой, кодирующий ту же аминокислоту. Например, если в мРНК произойдет замена третьего основания в кодоне ЦЦА, кодирующем пролин, этот кодон превратится либо в ЦЦУ, либо в ЦЦЦ, либо в ЦЦГ, которые все также кодируют пролин. Такие заме­ны оснований, сохраняющие «смысл» кодона, не влияют на свойства полипептида, синтезируемого под контролем гена, в котором произошла подобная замена, но могут замедлять скорость синтеза этого полипептида, потому что клетка обычно содержит неодинаковое количество разных изоакцепторных тРНК. Так, если подавляющее большин­ство присутствующих в клетке молекул тРНК^про принадлежит к способным узнавать кодон ЦЦА, а способные узна­вать кодон ЦЦУ представлены в меньшинстве, то транзиция, превращающая кодон ЦЦА в ЦЦУ, будет заметно сни­жать скорость синтеза полипептида, хотя и не вызовет изменения его первич­ной структуры.

Сшивки, образующиеся между азо­тистыми основаниями в пределах одной нити или соединяющие две нити моле­кул геномных нуклеиновых кислот, при­водят при последующей репликации молекулы либо к ее разрыву, либо к вы­падению нуклеотида, на месте которого может вставиться нуклеотид с другим (ошибочным) основанием. По-видимо­му, к аналогичным последствиям приво­дят и сшивки молекул нуклеиновых кислот с белками.

Молекулярные механизмы действия некоторых мутагенов. Лучше всего изучены молекулярные механизмы мутагенного действия аномальных азотис­тых оснований (5-бромурацила, 2-аминопурина и др.) и азотистой кислоты. Действие аномальных оснований про­является в образовании таутомерных форм азотистых оснований в результа­те перемещения атомов водорода в но­вое положение. Это может приводить к возникновению водородных связей меж­ду необычными парами оснований двух нитей молекулы ДНК. Такие таутомерные формы иногда возникают и без воздействия мутагенов (спонтанно) вслед­ствие случайных тепловых колебаний атомов в молекуле. Так, аденин в своем обычаем, т.е. наиболее вероятном состоянии (так называемой аминной форме), спаривается с тимином соседней нити той же молеку­лы ДНК. Однако в редких, но постоянно встречающихся с определенной час­тотой случаях аденин в результате тау­томеризации переходит в иминную форму и тогда он спаривается не с тимином, а с цитозином. Точно так же тимин в своей обычной кето-форме спаривается с аденином, но при таутомеризации переходит в энольную форму, предпочтительно спаривающуюся с гуа­нином.

Аномальные аналоги азотистых ос­нований нуклеиновых кислот таутомеризуются гораздо чаще, чем их обычные азотистые основания, а таутомеризация приводит к возникновению генных мута­ций. Рассмотрим, как это происходит на примере 5-бромурацила (сокращенно обозначаемого 5БУ), структурно очень близкого к тимину.

Введенный в клетку 5БУ в своей бо­лее частой кето-форме включается в синтезируемую нить ДНК на место тимина. Если при последую­щей репликации 5БУ перейдет в энольную форму, то во вновь образуемую комплементарную нить ДНК напротив 5БУ встроится не аденин, а гуанин, с которым энольная форма 5БУ предпочительно упаривается . При следующей репликации на нити, содер­жащей в этом месте гуанин, будет синтезироваться новая нить, в которой против гуанина встроится цитозин. Это означает, что возникла мутантная молекула ДНК, в которой пара А-Т исходной молекулы заменена парой Г-Ц. Г-Ц исходной молекулы окажется пара А-Т. Принципиально так же вызывают мутации и другие ано­мальные азотистые основания нуклеи­новых кислот.

Когда были выяснены молекулярные механизмы образования мутаций вследствие таутомеризации аномальных азотистых оснований, то стало оче­видным, что изредка происходящая таутомеризация нормальных оснований, должна быть одной из причин спонтан­ных мутаций, возникающих без всякого экспериментального воздействия.

Азотистая кислота вызывает генные мутации, непосредственно действуя на нуклеиновые кислоты. Она окислитель­но дезаминирует их азотистые основа­ния. При этом аденин превращается в гипоксантин, спариваю­щийся с цитозином вместо тимина, а цитозин под влиянием азотистой кисло­ты превращается в урацил, спариваю­щийся с аденином вместо гуанина. Во время последующей репликации обра­зуются мутантные молекулы ДНК, в которых в первом случае пара А-Т за­менена парой Г-Ц, а во втором случае, наоборот, пара Г-Ц заменена парой А-Т. Гуанин азотистая кислота превращается в ксантин, продолжающий спариваться с цитозином, а тимин и заменяющий его в РНК урацил не содержат аминогруппы, почему они и не изменяются под действием азоти­стой кислоты. Поэтому следует пола­гать, что вызываемые ею мутации обя­заны главным образом изменению аденина и цитозина.

Алкилирующие соединения, к числу которых относятся самые сильные из известных мутагенов (этилметансульфонат, нитрозометилмочевина и др.), химически изменяют азотистые основа­ния нуклеиновых кислот, вводя в них ос­татки углеводородов, главным образом метила и этила. Например, они превращают гуанин в 7-метилгуанин или 7-этилгуанин, аденин в 3-метиладенин, цитозин — в 1-метилцитозин и т.п. Чаще всего затрагивается аминогруппа гуанина. Измененные алкилирующими соединениями азотистые основания нередко образуют водород­ные связи с ошибочными партнерами и такие неверные спаривания приводят к возникновению генных мутаций по­добно тому, что имеет место при дейст­вии аномальных оснований или азоти­стой кислоты. Кроме того, алкилирующие мутагены иногда разрушают связь гуанина и реже аденина с дезоксирибозой, вследствие чего основание теряется и в такую депуринизированную нить ДНК на место выпавшего пурина мо­жет встроиться какое-нибудь другое основание, что также приводит к ген­ной мутации. Наконец, алкилирующие агенты химически изменяют фосфатные группы молекулы нуклеиновой кисло­ты и этим вызывают разрывы ее углеводнофосфатного скелета, следствием чего могут быть различные перестройки хромосом.

Акридиновые красители, из которых в качестве мутагена чаще всего исполь­зуется профлавин, образуют комплекс с ДНК, мешающий нормальному ходу её репликации. В результате получаются молекулы ДНК, в которых выпала или добавочно вставилась пара нуклеотидов, т.е. возникают мутации типа сдвига рамки считывания.

Ультрафиолетовые лучи вызывают разнообразные повреждения нуклеиновых кислот, из которых наибольшее мутагенное значение имеют гидратация пиримидинов, особенно цитозина, и об­разование димеров пиримидинов глав­ным образом тимина. Димеры пиримидинов, если они не удале­ны особыми репарирующими фермента­ми, о которых речь будет ниже, ведут к таким же мутациям, потому что димер не спаривается ни с одним осно­ванием и при репликации ДНК в синтезируемой цепи остается незаполненная брешь. Меньшее значение в мутагенном действии ультрафиолетового света имеют иногда вызы­ваемые им разрывы углеводно-фосфат­ного состава и некоторые другие изме­нения молекул нуклеиновых кислот.

В опытах на дрозофиле установлено, что генные мутации могут индуци­роваться введением любых вирусов — как неинфекционных, т.е. не способ­ных размножаться в ее клетках, так и инфекционных, размножающихся в них. Наряду с этим исследованиями на лабораторных млекопитающих и на их клетках, а также на клетках человека, культивируемых вне организма, пока­зано, что многие инфекционные для этих объектов вирусы могут вызывать разнообразные повреждения хромосом, иногда очень тяжелые, вплоть до пуль­веризации хромосом, т. е. распадения их на мелкие фрагменты. Можно пола­гать, что эти хромосомные аберрации, индуцируемые размножающимися в клетке вирусами, являются неспеци­фическим результатом патологических процессов, развивающихся в клетке при вирусной инфекции, коренным образом нарушающих весь метаболизм клетки и обычно ведущих к ее гибели.

Причиной генных мутаций могут быть и дефектные ДНК-полимеразы. Например, мутация, произошедшая в гене, кодирующем ДНК-полимеразу фага Т4, приводит к тому, что изменен­ная полимераза начинает при репликации ДНК ошибочно включать в строющуюся нить ДНК тимин не напротив аденина, а напротив цитозина матрич­ной нити, что при последующей репли­кации ведет к замене пары А-Т парой Г-Ц.

Репарация повреждений ДНК. Мно­гие повреждения ДНК, которые могли бы реализоваться в виде мутаций, не становятся таковыми, а исправляются особыми репарирующими механизма­ми клетки, представляющими эвслю-ционно выработанные приспособления, повышающие помехоустойчивость гене-гической информации и ее стабильность в ряду поколений. Принцип работы этих механизмов основан на том, что каждая молекула ДНК содержит два полных набора генетической информа­ции, записанной в комплементарных друг другу полинуклеотидных нитях ее двойной спирали: это обеспечивает со­хранение неискаженной информации в одной нити, даже если другая повреж­дена, и дает возможность использовать неповрежденную нить в качестве об­разца при исправлении возникшего де­фекта.

В настоящее время известно нес­колько механизмов репарации повреж­дений ДНК. Все они имеют ферментативную природу и исправляют только однонитевые повреждения. Наиболее хорошо изучены три таких механизма, на которых мы и остановимся, а именно фотореактивация, темновая репара­ция и пострепликативная репарация.

Явление фотореактивации заклю­чается в устранении видимым светом димеров тимина, особенно часто возни­кающих в ДНК под влиянием ультрафиолетовых лучей. Это осуществляется особым фотореактивирующим фермен­том, молекулы которого не обладают сродством с неповрежденной ДНК, но опознают димеры тимина и связываются с ними сразу после их образования. Даже если поврежденные молекулы ус­пеют реплицироваться, то это не всег­да дает начало мутациям, так как де­фекты синтезированных при реплика­ции дочерних молекул могут подвер­гнуться пострепликативной репарации. Комплекс, состоящий из димера тими­на и молекулы фермента, остается стабильным до тех пор, пока не под­вергнется действию видимого света. Видимый свет активирует молекулу фермента, она отделяется от димера тимина и одновременно разъединяет его на два отдельных тимина, восста­навливая этим исходную нормальную структуру ДНК.

Более сложен механизм темновой репарации, не требующей света. Этот механизм способен исправлять очень разнообразные повреждения ДНК, воз­никающие спонтанно или вызванные действием разных физических и химических мутагенов (димеры пиримидинов, наличие неправильных пар основа­ний, однонитевые разрывы и др.). Темновая репарация протекает в несколько этапов и при участии нескольких ферментов.

Явление репарации ДНК распространено очень широко, от бактерий до высших растений, животных и челове­ка и несомненно имеет важное значение для сохранения стабильности пере­даваемой из поколения в поколение генетической информации.

Трансформация, трансдукция, сексдукция. Предпосылкой всякой рекомбинации, а следовательно, и комбинативной изменчивости вообще, является возникновение гетерозиготности по двум или более генам — ведь очевидно, что у гаплоида или у полностью гомозиготного по всем генам диплоида неоткуда взяться новым сочетаниям ге­нов. У эукариотов гетерозиготность, ве­дущая к рекомбинациям, почти всегда представляет следствие скрещивания. В отличие от этого у прокариотов она может возникать несколькими путями, что обусловлено наличием у них раз­ных способов передачи генетической информации от одной клетки другой,— конъюгации, трансформации, трансдукции и сексдукции.

Явления трансфромации, трансдукции, сексдукции и коньюгации описаны в разделе «Генетика микроорганизмов».

Молекулярный механизм конъюга­ции хромосом. У эукариотов необходи­мой предпосылкой рекомбинации как несцепленных генов, лежащих в разных хромосомах, так и сцепленных генов, локализованных в одной и той же хромосоме, является конъюгация гомоло­гичных хромосом, обеспечивающая пра­вильное их распределение во время мейоза и делающая возможным обмен их частями путем кроссинговера.

Хотя конъюгация хромосом извест­на очень давно, лишь в самые послед­ние годы удалось пролить свет на лежащие в ее основе молекулярные процессы, понять, почему во время мейоза гомологичные хромосомы продольно соединяются попарно, как они опознают друг друга, чем обусловлено высокоспецифичное взаимное притяже­ние соответствующих точек по всей длине двух конъюгирующих хромосом, особенно наглядно заметное в случае различных хромосомных перестроек и определяющее тождество мест разрыва обоих партнеров при кроссинговере.

Современные представления о меха­низме мейотической конъюгации хромосом основаны на недавних исследо­ваниях, проведенных молекулярно-биологическими и цитологическими мето­дами главным образом на культурах клеток растений во время мейоза в них. Эти работы не только очень углубили представления о поведении хромосом в мейозе, но дали и важные новые све­дения, касающиеся общих вопросов организации генома.

Было установлено, что в ДНК хромосом эукариотов по всей их длине разбросано множество коротких участков, ответственных за мейотическое притяжение гомологичных хромосом друг к другу. Эти участки, длиной в среднем порядка 100 пар нуклеотидов каждый, получили название зиготенной ДНК, или, сокращенно, зДНК (ниже станет ясно, почему их так называют). В общей сложности они занимают около 0,3% общей длины ДНК и представляют уникальные последовательности нуклеотидных пар, т.е. все они различны. Число их очень велико и, по-видимому, приблизительно соотвествует числу генов, поэтому предполагают, что либо в каждом гене, либо в каждом межгенном промежутке присутствует такой маленький участок зДНК.

В интерфазе, предшествующей первому мейотическому делению, происхо­дит репликация всей ДНК хромосом, кроме участков зДНК, репликация которых задерживается: Поэтому к на­чалу первого деления мейоза, т.е. на лентотенной стадии, ДНК хромосом удвоена ч на всем протяжении, за исклю­чением вкрапленных в нее участков зДНК. Этого не наблюдается в митозах - там зДНК реплицируется одновременно со всей остальной ДНК. Составлена предположи­тельная схема дальнейших событий. По всей видимости, эта схема в основ­ном соответствует действительности, хотя не все ее детали строго доказаны и она опирается на исследования пока лишь ограниченного числа объектов.

Участки зДНК контактируют по всей длине двух конъюгирующих хро­мосом, а остальная ДНК (т. е. подав­ляющая ее часть) в виде суперспирализованных соединенных с гистонами нитей образует большие извитые петли, перпендикулярные оси хромосом и хо­рошо видимые на препаратах. Затем, в начале зиготенной стадии, в конъюги­рующих хромосомах появляется белок, способный расплетать двойную спираль ДНК; этот белок тождествен или ана­логичен белку, обладающему той же функцией (геликазе). Расплетающий белок разъединяет зДНК после чего одиночные зДНК двух гомо­логичных хромосом комплементарно соединяются водородными связями, об­разуя гетеродуплекс, т.е. гибридную двойную спираль, нити которой принад­лежат разным хромосомам. Специфич­ность узнавания нитей в гетеродуплексах определяется уникальностью по­рядка нуклеотидов в каждом участке зДНК, вследствие чего гетеродуплексы возможны только между комплемен­тарными нитями гомологичных, но не разных участков. Образуются гетеро­дуплексы не сразу по всей длине конъю­гирующих хромосом, а прогрессируя постепенно, подобно тому, как соеди­няются половинки застежки «молния».

Наряду с возникновением таких контактов между конъюгирующими хромосомами идет формирование так называемого синаптонемального комп­лекса, состоящего из двух продольных белковых тяжей, соединенных между собой тонкими поперечными белковыми волокнами, Синаптонемальный ком­плекс выполняет две функции: он не по­зволяет конъюгирующим хромосомам необратимо слипнуться и закрепляет расположение гомологичных генов этих хромосом точно друг против друга, что необходимо для последующего кроссин­говера.

Когда пара хромосом скреплена по всей длине синаптонемальным комплек­сом, то гетеродуплексы зДНК распа­даются. Их нити разъединяет распле­тающий белок и каждая из одиночных нитей наконец реплицируется (именно из-за такой задержки репликации до зиготенной стадии зДНК получила свое название). Притяжение гомологичных хроматид в политенных хромосомах пред­положительно тоже обязано имеющим­ся в них участкам зДНК.

Молекулярные механизмы кроссинговера. Хотя молекулярные процессы, происходящие при кроссинговере, рас­крыты еще не полностью, все же к на­стоящему времени накоплены важные сведения, проливающие свет на их сущ­ность.

Прежде всего нужно отметить решение главного вопроса о принципе, ле­жащем в основе рекомбинации сцеплен­ных генов. По этому поводу в генетике долго существовали две на первый взгляд исключающие друг друга гипо­тезы. Одна из них — гипотеза «разрыва и воссоединения» — является, по сути дела, молекулярно-биологической интерпретацией классической теории хиазмотипии, рассмотренной нами в лекции 7. Согласно этой гипотезе, кроссинговер осуществляется путем разрывов, возни­кающих одновременно в тождественных точках двух родительских молекул ДНК и последующего ковалентного соединения образовавшихся фрагмен­тов в новых сочетаниях. Таким обра­зом, по этой гипотезе кроссинговер протекает без репликации ДНК, а кроссоверная молекула ДНК составлена из вещества двух родительских моле­кул. Другая гипотеза, названная ги­потезой «выборочного копирования», предполагает, что при кроссинговере вовсе не происходит обмена участка­ми между родительскими молекулами ДНК, но записанная в них генетиче­ская информация частично передается вновь синтезируемой молекуле во вре­мя репликации: эта молекула при своем росте сначала использует в качестве матрицы нить одной родительской молекулы, а затем переключается на ис­пользование нити другой родительской молекулы. Таким образом, согласно этой гипотезе кроссинговер осуществляется в процессе репликации ДНК, а связь кроссоверной молекулы ДНК с родительскими имеет чисто ин­формационный характер: часть полу­чаемой ею генетической информации поставляет один родитель, часть — вто­рой, вещество же родительских моле­кул в кроссоверную молекулу не попа­дает.

Исследования последних двух деся­тилетий однозначно показали, что при кроссинговере всегда происходит реаль­ный обмен частями двух молекул ДНК и, следовательно, правильна гипотеза «разрыва и воссоединения», а не гипо­теза «выборочного копирования».

Хотя у эукариотов к началу пахи­тенной стадии полностью закончена репликация всех хромосом, в течение этой стадии все же обнаруживается синтез небольшого количества ДНК. Этот синтез не увеличивает содержания ДНК в ядре, а приводит к замене некоторых уже имеющихся ее участков и протекает не так, как это бывает при обычной репликации хромосомной ДНК, а по типу репаративного синтеза: сначала эндонуклеаза надрезает одну из нитей наличной молекулы ДНК, затем экзонуклеаза расширяет разрыв и только после этого ДНК-полимераза синтезирует недостающий от­резок нити, восстанавливая ее целост­ность. Синтез этой ДНК, получившей название пахитенной ДНК (сокращен­но пДНК), приурочен к разбросанным по хромосомной ДНК очень многократ­но повторенным небольшим участкам с одинаковой последовательностью нуклеотидных пар во всех них; в общей сложности участки эти составляют око­ло 0,1% длины всего генома. Вывод о существовании таких участков, по-види­мому, справедлив не только для эукариотов, но также для бактерий и виру­сов. К настоящему времени получено много данных в пользу того, что и у них при кроссинговере первоначальные раз­рывы ДНК происходяг избирателыю в определенных точках хромосомы.

Синтез пДНК осуществляется, по-видимому, теми же реларирующими и реплицирующими ДНК ферментами, которые присутствуют в соматических клетках. Исключение составляет толь­ко эндонуклеаза, вызывающая первона­чальные однонитевые разрывы при син­тезе пДНК: она отличается по своим физико-химическим свойствам от ана­логичного фермента соматических кле­ток, появляется в мейотических клетках только на пахитенной стадии и исче­зает после ее окончания. Этой специ­фичной для пДНК эндонуклеазе при­своено название «никаза» (от англий­ского слова nick, означающего надрез).

На пахитенной стадии митоза эти многократно повторенные участки, в которых происходит синтез пДНК, лежат в просвете синаптонемального комплекса там же, где участки зДНК и, вероятно, непосредственно примыкают к ним. Предполагается, что у эукариотов участки пДНК имеются в каждом гене или каждом межгенном промежутке и что кроссинговер может происходить только в них, причем тождество нуклеотидной последовательности этих участков обеспечивает в любом из них возможность первоначального надрезания нити ДНК одной и той же никазой, опознающей эту последовательность.

То обстоятельство, что в настоящее время в генетике существует несколько гипотез, каждая из которых предлагает отличную от других молекулярную модель кроссинговера означает, что в этом вопросе еще не достигнуто полной ясности; приходится отметить, что во всех выдвинутых за последние годы гипотезах этого рода имеются спорные допущения, опирающиеся скорее на догадки, чем на прочно установленные факты. Тем не менее в этих гипотезах есть и ряд объединяющих их общих по­ложений, правильно отражающих некоторые важные стороны молекулярных механизмов кроссинговера. Мы рассмотрим здесь две такие гипотезы, наиболее широко обсуждаемые в современной генетической литературе.

Согласно гипотезе, предложенной английским генетиком Холлидеем, первый акт кроссинговера состоит в возникновении однонитевых разрывов ДНК конъюгирующих гомологичных хромосом. Такие разрывы происходят в нитях ДНК одинаковой полярности и вызываются специфической эндонуклеазой (никазой), избирательно узнающей последовательность нуклеотидов в особых участках, с которых на­чинается кроссинговер (Холлидей называет эти рассеянные по длине хромо­сомы участки «рекомбинаторами»). Первичные разрывы позволяют расплетающему белку разъединить нити ДНК, после чего две претерпевшие разрыв нити обмениваются концевыми фрагментами и каждая комплементарно спаривается с интактной нитью другой молекулы, так что кроссоверные нити оказыва­ются перекрещенными (полухиазма). В результате две образовавшиеся хроматиды состоят на своих концах из родительских нитей ДНК, а в середине из участков, полученных от разных ро­дительских молекул. Как уже говори­лось, такие «гибридные» участки ДНК называются гетеродуплексами.

Другая гипотеза о молекулярном механизме кроссинговера, выдвинутая английскими генетиками Уайтхаузом и Хэстингсом, тоже исходит из предпо­ложения, что первичные однонитевые разрывы, с которых начинается кроссин­говер, происходят в определенных точ­ках ДНК, но только при этом в гомо­логичных хроматидах рвутся нити не одинаковой, а разной полярности. После разрыва нити ДНК в обоих хроматидах расплетаются и разъединяются, а вдоль оставшихся неразорванными нитей начинается синтез новых, нитей. Эти новые нити пере­крестно спариваются с разошедшимися старыми и продолжают расти, исполь­зуя последние в качестве матрицы. Понятно, что обра­зующиеся таким путем кроссоверные молекулы в своей средней части пред­ставляют гетеродуплексы. Заканчивается процесс рекомбинации разру­шением оставшихся неспаренными час­тей родительских нитей ДНК.

Несмотря на существенные различия двух рассмотренных гипотез о молеку­лярных механизмах кроссинговера, они имеют и важные общие черты, которые следует перечислить, так как они отра­жают наиболее надежно обоснованные выводы многочисленных эксперимен­тальных работ в данной области. Вот эти положения, общие для гипотезы Холлидея и гипотезы Уаитхауза и Хэстингса. Начинается кроссингонер однонитевыми разрывами, вызываемыми специфической эндонуклеазой в опре­деленных местах молекул ДНК хроматид конъюгирующих хромосом. Даль­нейшие этапы включают разъединение нитей ДНК расплетающим белком, час­тичное разрушение их экзонуклеазой и репаративный синтез нитей со сменой матриц, осуществляемый полимеразами; образование при этом гетеродуплексов, в которых может происходить конвер­сия; замыкание лигазой соединивших­ся концов нитей. Эти же положения ха­рактеризуют и некоторые другие ги­потезы о молекулярных механизмах кроссинговера, здесь не приведенные и представляющие в основном модифи­кации двух описанных выше.

Некоторые экспериментальные дан­ные, полученные в самые последние годы, а также ряд теоретических со­ображений говорят в пользу гипотезы Холлидея, которая, по-видимому, пра­вильнее отражает действительный молекулярный механизм кроссинговера, чем гипотеза Уайтхауза и Хэстингса.

Как уже отмечалось, углубленное изучение особых хромосомных перестроек, по­лучивших название транспозиции, на­чалось только в самые последние годы и мы до сих пор не имеем достаточных сведений, чтобы составить полное представление о природе и значении этих перстроек.

Мобильные элементы генома. Напомним, что транспозиция – это встраивание (инсерция) в какое-либо место хромосомы фрагмента ДНК, содержащего ген или гены, нормально не свойственные этому участку хромосомы, т.е. не гомологичные присутствующим там генам. Генетические элементы, способные к транспозиции (ТЭ), могут быть разной длины – очень короткие (500 -1500 пар нуклеотидов, как ИС-элементы бактерий), несколько более длинные (3000-25000 пар нуклеотидов, как транспозоны бактерий) и относительно весьма крупные – десятки тысяч пар нуклеотидов, как некоторые ТЭ дрозофилы, которые настолько велики, что их даже удается разглядеть в оптический микроскоп.

Но какого бы размера не были ТЭ, для них всех характерны некоторые общие особенности генетического строе­ния. Два конца ТЭ, по-видимому, всег­да представляют повторы одинаковых последовательностей нуклеотидных пар. Длина таких концевых повторов может быть очень различной у разных ТЭ (от двух — трех десятков до почти 1500 пар нуклеотидов), но постоянна для каждо­го ТЭ. У бактериальных ТЭ эти концевые повторы всегда палиндромные, т.е. инвертированы по отношению друг к другу (А-Б-В-Г-Д.... Д-Г-В-Б-А), но у ТЭ эукариотов они обычно прямые, т. е. ориентированы одинаково (А-Б-В-Г-Д... А-Б-В-Г-Д). Между концевы­ми повторами, т.е. в центральном участке ТЭ, находится ген или гены, ответственные за способность ТЭ перемещаться с места на место. У всех ба­ктериальных ТЭ и по крайней мере у ТЭ некоторых эукариотов, например дрожжей, вплотную к обоим концам ТЭ, но вне его, имеются маленькие дуп­ликации отрезков хромосомы реципи­ента; эти дупликации очень малы— в случае разных ТЭ они состоят всего из 5, 9 или 11 нуклеотидных пар и пре­дставляют прямые повторы прилегаю­щих к ТЭ последовательностей нукле­отидных пар репипиентной хромосомы. Как концевые повторы внутри ТЭ, так и маленькие дупликации вне ТЭ, не­сомненно, как-то связаны с процесса­ми инсерции и эксцизин ТЭ, но конкретная роль их в этих событиях пока не известна.

В простейшем случае структура ТЭ этим и ограничивается. В более сложных ТЭ, в центральной час­ти добавляются ген или гены, не имею­щие прямого отношения к транспози­ции; как правило, это гены, захвачен­ные ТЭ из хромосомы клетки или плазмиды. Так, например, бактериальный транспозон ТЗ, придающий клетке устойчивость к ампициллину, несет в своей центральной части три гена: один, кодирующий фермент бета-лактамазу, сообщающий бактерии устой­чивость к ампициллину, затем ген, коди­рующий фермент транспозазу, осу­ществляющий транспозицию ТнЗ, и, наконец, ген-репрессор, регулирующий транскрипцию гена транспозазы и самого себя. Более крупные ТЭ могут захватывать и перебрасывать в преде­лах генома хозяина по несколько генов сразу.

По своей способности встраиваться в разные места генома, т.е. по специ­фичности мест инсерции, ТЭ сильно различаются между собою. Есть такие ТЭ, которые могут встраиваться во мно­жество, по-видимому, совершенно слу­чайных мест генома. Однако большинство ТЭ проявляет ту или иную степень инсерционной специфичности, начиная от таких ТЭ, которые встраи­ваются во многие места генома, но все же предпочтительно в некоторые из них, до таких, которые встраиваются толь­ко в определенный участок хромосомы или даже в единственный определенный локус.

Эксцизия ТЭ, т.е. освобождение ТЭ из хромосомы, в которую он был встро­ен, чаще всего не влечет за собой како­го-либо нарушения целостности ТЭ, т.е. разрывы при эксцизии происходят точно по границам, разделяющим концы ТЭ от прилегающих участков реципиентной хромосомы,

Встраиваясь в хромосому, ТЭ вызы­вают там мутации. Выше уже говори­лось, что у границ ТЭ в хромосоме-ре­ципиенте всегда возникают маленькие дупликации, что, по-видимому, обу­словлено самим механизмом инсерции ТЭ. Но и помимо этого ТЭ довольно часто (но не всегда) индуцируют вблизи места встройки в хромосому генные мутации, делеции и инверсии.

У прокариот существуют три типа мобильных элементов –IS-элементы, транспозоны и некоторые бактериофаги. IS-элементы содержат минимальное число генов, необходимых для мобилизации элемента и его инсерции в новый участок хромосомы. IS-элементы являются обычным компонентом бактериальных хромосом и плазмид. На концах IS-элементов находятся инвертированные повторы IR, длина которых варьирует от 22 до 41пн. В участке встраивания IS –элементов в геномной ДНК образуется дупликация размером от 5 до 9 пн. Три инсерционных элемента – ISI, IS2 и ISIOR представлены в геноме E.coli в 0-30 копиях. Их размеры варьируют от 768 до 1329 пн. Некоторое число копий этих элементов встречается в плазмидах. Они содержат ген транспозазы.

Поскольку IS-элементы встраиваются в любой участок ДНК, они часто вызывают мутации, разрушая кодирующие или регуляторные последовательности. Промоторы в самом IS-элементе могут влиять на экспрессию соседних генов.

В процессе перемещения IS-элементов происходит точное копирование уже встроенного элемента, затем старая копия остается на месте, а вновь синтезированная внедряется в новый сайт. Транспозиция происходит с использованием транспозазы, которая опознает İR-последовательности, где и иницируется транспозиция.

Бактериофаг Ми, инициирующий E.coli, в то же время является транспозоном и может вызывать мутации в результате встраивания.

По-видимому, число транспозонов, т.е. участков ДНК, способных кочевать в геноме с места на место, довольно значительно у любого организма. В единственной хромосоме кишечной палочки всегда присутствует с десяток или даже больше транспозонов. У дрозофилы с ее гораздо более крупным геномом их во много раз больше. Как уже отмечалось в разделе 15, мобильные дис­пергированные гены представлены в геноме дрозофилы десятками и сотнями копий и найдены сходные многочис­ленные кочующие гены у мышей и дрожжей. Можно полагать, что они имеются у всех эукариотов.

В геноме человека SINE (short interspersed nuclear element) представлены семейством Alu-повторов. Члены этого семейства имеют длину 300 пн и повторены в геноме от 300000 до 500000 раз. Около 3% генома человека составляют Alu-повторы. Каждая Alu‑последовательность фланкирована прямыми повторами от 7 до 20 пн. по этой причине полагают, что Alu-повторы являются мобильными элементами, скорее всего ретротранспозонами.

Наличие мобильных элементов в геномах имеет разнообразные генетические последствия.

1. Перемещения и внедрение мобильных элементов в гены может вызывать мутации.

2. Изменение состояния активности генов.

3. Формирование хромосомных перестроек.

4. Формирование теломер.

5. Участие в горизонтальном переносе генов.

6. Транспозоны на основе P-элемента используют для трансформации у эукариот, клонирования генов, поиска энхансеров и т.д.

Транспозиции, вероятно играли до­вольно существенную роль в эволюции прокариотов (во всяком случае, бакте­рий), позволяя обмениваться генами даже видам, у которых отсутствует конъюгация и поэтому рекомбинация не осуществима обычным путем. Очень небольшое значение могли иметь транс­позиции и в эволюции эукариотов, слегка повышая частоту мутаций и этим расширяя материал, с которым оперирует естественный отбор.

Но если транспозиции едва ли сколько-либо сильно влияли на эволюцию эукариотов, то роль их в индивидуальном развитии эукариотов, возможно, весьма значительна.

Вопросы

1. Какие повреждения в нуклеиновых кислотах приводят к возникновению мутаций?

2. Какие кодоны являются терминирующими?

3. Что означает таутомерные формы и как они возникают?

4. Какие типы репарации ДНК Вам известны?

5. Какие ДНК синтезируются при коньюгации хромосом?

6. Какие гипотезы о молекулярных механизмах кроссинговера Вам известны?

7. Какие типы мобильных элементов существуют у прокариот?

8. Какова роль мобильных элементов?

9. Чем отличаются транспозоны от IS-элементов?

ЛЕКЦИЯ 17