Генетика микроорганизмов

1. Эукраиотические микроорганизмы

2. Прокариотические микроорганизмы

3. Бактериофаги

4. Рекомбинация у микроорганизмов

5. Трансформация

6. Трансдукция

7. Коньюгация

8. Внехромосомоные генетические элементы микроорганизмов.

Генетика микроорганизмов зародилась в 1940 г., когда Г.Бидл и Э.Татум поставили классические эксперименты по получению и анализу индуцированных мутаций у гриба Neurospora crassa. Эти опыты позволили сформулировать концепцию «один ген — один фермент» и положили начало современной биохимической генетике. Вскоре в круг объектов генетических исследований были вклю­чены и другие микроорганизмы — прокариоты (бактерии, синезеленые водоросли), эукариоты (грибы и водоросли) и вирусы, в первую очередь вирусы бактерий — бактерио­фаги.

Благодаря этим исследованиям на микроорганизмах была установлена роль ДНК как генетического матери­ала, выяснены тонкая структура генов и принципы регу­ляции их действия, расшифрована общая природа гене­тического кода, раскрыты многие молекулярные меха­низмы репликации, рекомбинации, репарации и мутагенеза ДНК.

Исследования по генетике микроорганизмов в значи­тельной мере способствовали возникновению новых отрас­лей биологии (молекулярной биологии, молекулярной генетики, вирусологии, биотехнологии) и новых аспектов классических биологических наук (изучение эволюции и систематики различных видов путем сравнения структур­ной организации их генов и генных продуктов, исследо­вание молекулярных механизмов канцерогенеза и старения; изучение возможности межвидового обмена генетическим материалом в природе и т.д.). Важное значение имеет генетика микроорганизмов и для медицины. С ее помощью расшифрованы многие молекулярные механизмы патогенности микробов и их устойчивости к лекарственным препаратам, причины появления атипичных форм пато­генных бактерий. Углубленное изучение генетики микроорганизмов позволило использовать их в качестве тест-систем для выявления факторов загрязнения окружающей среды. Наконец, достижения молекулярной генетики микроорганизмов, открытые ею закономерности, ее идеи и методы легли в основу наиболее современного направле­ния биологической науки — генной инженерии.

Эукариотические микроорганизмы. Нейроспора. Первым микроорганизмом, использован­ным для генетических исследований, стала нейроспора Neurospora crassa — плесневый хлебный гриб из класса аскомицетов. Размножается бесполым (вегетативным) и половым путем. В вегетативном состоянии тело гриба представляет собой мицелий, от которого отхо­дят вверх спороносные гифы — конидиеносцы, содержа­щие цепочки спор — конидий. Они образуются вследствие митотического деления гаплоидных клеток мицелия. Кони­дии пигментированы и придают колониям характерный цвет (от розового до оранжевого). Зрелые конидии легко отделяются от гиф и разносятся по воздуху. Попадая в благоприятные условия, они прорастают и вновь обра­зуют вегетативный мицелий, который состоит из много­ядерных клеток, причем каждое ядро гаплоидно и содер­жит семь хромосом. Нейроспора — гетероталличный гриб, т.е. оплодотворение возможно лишь между клетками раз­ного происхождения и разных типов спаривания (А либо а). Гаплоидный мицелий образует незрелые плодовые тела — протоперитеции, которые оплодотворяются конидиями или гифами мицелия противоположного типа спаривания. Диплоидное ядро образующейся зиготы дважды мейотически делится, что приводит к удлинению клетки и образо­ванию сумки (аска), в которой находятся гаплоидные продукты мейоза — четыре аскоспоры. Каждая аскоспора содержит одну из хроматид тетрады, образующейся в диплотене мейоза и состоящей из четырех хроматид от двух хромосом (материнской и отцовской). Четыре аскоспоры одного аска обычно называют тетрадой, отсюда анализ проводимый по гаплоидным продуктам мейоза, называют тетрадным. Вслед за мейотическими делениями происходит митотическое, в результате которого в каждом аске образуются восемь (четыре пары) аскоспор. Аскоспоры в одном аске после митотического деле­ния называют октадой. Существенно, что линейное распо­ложение аскоспор в аске соответствует ходу мейотического деления, поэтому порядок расположения аскоспор позволяет судить об их происхождении относительно эта­пов мейоза. Если аскоспоры будут различаться между собой (например, окраской), то можно подвергнуть ана­лизу расщепление признаков в процессе мейоза.

Дрожжи. Это одноклеточные грибы, различающиеся по типу деления. К почкующимся относятся сахаромицеты (Accharomyces cerevisiae), к равноделящимся — шизо-сахаромицеты (Schiziaccharomyces pombe). Вегетативный рост дрожжей сменяется половым размножением, поэтому их жизненный цикл включает стадии митоза и мейоза. Вегетативные клетки (в отличие от нейроспоры) диплоидные. Известны два вида штаммов дрожжей — гетероталличные и гомоталличные.

Использование сахаромицетов дает ряд уникальных возможностей для генетического анализа, в том числе возможность исследования закономерностей рекомбина­ции на стадии четырех хроматид с помощью тетрадного анализа. В отличие от мицелиальных грибов клетки дрож­жей одноядерны, что служит важным преимуществом для количественной оценки мутационного процесса, проведения радиобиологических исследований и т. д.

Прокариотические микроорганизмы. К микроорганизмам — прокариотам — относятся цианобактерии (синезеленые водоросли), бактерии и близ­кие к ним актиномицеты. Наиболее генетически изучены различные представители истинных бактерий (Eubacteriales). Средний размер клеток 0,8-1,5 мкм в длину и 0,5-2 мкм в ширину.

Морфология клеток бактерий, несмотря на их значи­тельное функциональное разнообразие, имеет принци­пиально общие черты. Бактерии окружены клеточной стенкой, основу которой составляют пептидогликан или муреин, определяющий ее плотность и ригид­ность (упругость). Клеточная стенка обусловливает ха­рактерную для данных бактерий форму (палочковидную, шаровидную и др.). Химический состав и строение клеточ­ной стенки специфичны для определенных групп бакте­рий. В зависимости от отношения к окраске по методу К.Грамма бактерии разделяют на грамположительные и грамотрицательные.

В цитоплазме бактерий, заполняющей полость клетки, отграниченную цитоплазматической мембраной, содер­жатся мезосомы, рибосомы, плазмиды и нуклеоид. Здесь же присутствуют растворимые белки, например, белки-репрессоры различных индуцируемых оперонов, многие ферменты.

Нуклеоид бактерий и других прокариот представляет собой эквивалент ядра клетки эукариот. Он не окружен мембраной, отделяющей у эукариот ядро от цитоплазмы, а расположен в виде компактной массы в центре клетки, занимая свыше 1/3 ее объема. В состав нуклеоида входят ДНК, РНК и белки. Число нуклеоидов в бакте­риальной клетке может варьировать от одного (в культу­рах, находящихся в стационарной фазе роста) до двух (в стадии задержки размножения после переноса клеток в свежую среду) и четырех (в культурах с постоянной скоростью роста). Каждый нуклеоид содержит двухцепочечную замкнутую в кольцо молекулу ДНК с М_r(1—3) • 10⁹. В молекуле ДНК нуклеоида закодирована вся генетическая информация, необходимая для жизнедеятельности клетки, поэтому нуклеоид рассматривают как бактериальную хромосому. Кольцевое строение бактериальной хро­мосомы было доказано Дж.Кэрнсом (1963) методом ра­диоавтографии. Гигантская молекула ДНК бактериальной хромосомы поддерживается связанными с ней молекулами РНК и белка в форме компактной струк­туры, свернутой в отдельные сверхспирализованные петли (домены), число которых колеблется от 12 до 80. Типич­ная бактерия содержит около 10^-11 мг ДНК или 2·10⁷ нуклеотидов с общей длиной 1100 мкм, что в 1000 раз пре­вышает длину самой бактериальной клетки.

Помимо хромосомной ДНК в состав генома многих прокариот входят также сверхскрученные, ковалентно-замкнутые кольцевые молекулы внехромосомной, или плазмидной, ДНК, по величине составляющие в среднем около 1/100 бактериальной хромосомы.

Распределение (сегрегация) ДНК хромосом и плазмид между делящимися клетками происходит без видимой реорганизации внутренней структуры, характерной для митозов у эукариот, и без образования веретена. Данные электронно-микроскопического исследования спорообразующих бацилл показывают, что нуклеоид прикреплен к мезосоме — структуре, сформированной путем впячивания цитоплазматической мембраны в цитоплазму. По­добные прикрепления к участкам мембраны характерны и для плазмид на определенных стадиях клеточного цикла. После окончания репликации ДНК хромосом и плазмид отреплицированные дуплексы разделяются благодаря разрастанию мембраны между участками присоединения с двух молекул ДНК, образовавшихся в процессе репликации. Молекулы ДНК расходятся к полюсам клетки, которая затем разделится на две дочерние. В настоящее время из огромного числа существующих в природе бактерий генетически изучено сравнительно немного. К наиболее исследованным в этом отношении объектам относится кишечная палочка (Escherichia coli), непатогенный для человека возбудитель мышиного тифа (Salmonella typhimurium), различные виды бактерий из рода Pseudomonas, вступающие в симбиоз с растениями бактерии из семейства Rhizobiaceae, непатогенный сапрофит сенная палочка (Bacillus subtilis), некоторые виды стрептококков и стафи­лококков, способная к фиксации атмосферного азота бактерия вида Klebsiella pneumoniae, различные фотосинтезирующие азотфиксаторы, включая цианобактерии, и не­которые другие. Генетические исследования проводят и на актиномицетах, из которых многие являются продуцен­тами широко используемых антибиотиков.

Бактериофаги. Вирусы бактерий – бактериофаги, или фаги могут быть разделены на два класса - вирулентные и умеренные. Среди вирулентных фагов наиболее изучены - семь фагов Т-группы (от англ. type – тип), в свою очередь, включающие подгруппы Т-четных (Т2, Т4, Т6) и Т-нечетных (Т1, Т3, Т5, Т7). Фаги Т-группы паразити­руют на клетках Е.соli. Независимо от принадлежности к определенной группе жизненный, или литический, цикл вирулентных фагов включает пять стадий: 1) адсорбцию фага на поверхности бактериальной клетки; 2) проник­новение фаговой ДНК (или РНК в случае РНК-содержащих бактериофагов) внутрь клетки; 3) внутриклеточное развитие (репродукция фаговых ДНК или РНК внутри клетки); 4) созревание (сборка зрелых фаговых частиц); 5) лизис клеток. Все эти процессы происходят достаточно быстро. Так, одна частица фага Т4 при заражении клеток Е. cоli уже через 20-25 мин образует 200-400 частиц фагового потомства.

Структуру и химический состав фагов можно рассмо­треть на примере внешне не отличающихся друг от друга фагов Т-четной группы, имеющих сперматозоидную форму. Они состоят из головки гексагональной формы и отходя­щего от нее хвостового отростка. В головке фага находится молекула ДНК, окруженная белковой оболочкой. Хвостовой отросток обеспечивает прикрепление фаговой частицы к бактерии. Отросток состоит из полого стержня диаметром около 2,5 нм, окруженного полым футляром, или чехлом, способным к сокращению. Один конец стержня прикреплен к головке, другой — к шестиугольной базальной пластинке, от которой отходят корот­кие зубцы с длинными нитями на концах. Длина всего фага от конца хвостового отростка до вершины головки составляет около 200 нм, ширина головки — около 50- 60 нм. Белковая оболочка головки фага, называемая капсидом, а также футляр отростка состоят из упорядочен­ных полипептидных субъединиц. Сокращение футляра позволяет стержню отростка проникнуть сквозь клеточную оболочку и «впрыснуть» фаговую ДНК в клетку. При этом белковая оболочка фага остается снаружи. Избиратель­ность проникновения в клетку фаговой ДНК была продемонстрирована А.Херши и М.Чейз.

У Т-четных фагов упакованная в фаговой головке ДНК состоит примерно из 200 тыс. п.н., образующих около 100 генов, и имеет длину 34 мкм, что в сотни раз превышает длину самой головки.

ДНК фагов, как и вирусов животных, различается по структуре. Она может быть одноцепочечной: линейной (парвовирус) или кольцевой (фаги φX174, fd); двухцепочечной: линейной (фаг Т7), с одноцепочечными разры­вами (фаг Т5), с замкнутыми концами (вирус оспы) и ковалентно-замкнутой кольцевой сверхспирализованной (паповавирус). Концы линейных молекул вирусных ДНК содержат различные типы повторов. Это либо инвертиро­ванные (обращенные) повторы (парвовирус, аденовирус), либо концевая избыточность как с циклическими переста­новками нуклеотидов — пермутациями (фаг Т4), так и без них.

Характерная черта вирулентных фагов — последова­тельная экспрессия входящих в их состав «ранних» и «поздних» генов. Если проследить за биохимическими изменениями, происходящими, например, в клет­ке, зараженной фагом Т4, то оказывается, что в первые минуты после адсорбции под контролем «ранних» генов синтезируются иРНК, необходимые для синтеза ДНК и других структурных компонентов зрелого фага. Через 6 мин после адсорбции общий уровень синтеза ДНК в клетке резко повышается, что отражает начало синтеза фаговой ДНК. За 20-25 мин, составляющих скрытый (латентный) период внутриклеточного развития бактериофага, успе­вают образоваться сотни копий фаговой ДНК. С 9-й ми­нуты после инфекции под контролем «поздних» генов, транскрибирующихся в условиях активной репликации ДНК, с помощью модифицированной РНК-полимеразы хозяина начинают синтезироваться специфичные фаговые белки. Эти белки «одевают» фаговую ДНК в процессе сборки зрелых фаговых частиц. Выход их из клетки приво­дит ее к гибели.

В отличие от вирулентных умеренные фаги имеют два цикла развития — литический и лизогенный. При заражении бактерий умеренным бакте­риофагом он может перейти в вегетативное состояние, характерное для вирулентных фагов, что приведет к лизису клетки, либо в состояние профага, при котором бактериальная клетка не погибает. Пример умеренных фагов — фаги γ и φ 80 E.coli. Носительство умеренных фагов в форме профагов — широко распространенное свойство различных видов бактерий. Некоторые из них содержат одновременно по нескольку профагов. Переход фага в состояние профага связан с включением фаговой ДНК в состав бактериальной хромосомы. При этом ДНК профага реплицируется как часть хромосомы клетки-хозяина. Бактерии, в хромосоме которых находится профаг, называют лизогенными. Характерное свойство лизогенных бактерий — иммунитет к литической инфекции осуществляемой тем же или близкородственным фагом.

Рекомбинация у микроорганизмов. Независимо от того, как происходит перенос генети­ческого материала у бактерий — трансформацией, трансдукцией или конъюгацией,— формирование рекомбинантного потомства связано со стабильной интеграцией экзогеноты (гена или группы генов донора) с эндогенотой (геномом реципиента), обусловливающей возможность наследования этой новой генетической информации в ряду поколений.

Исходная структура для образования рекомбинантной хромосомы — мерозигота, т.е. реципиентная клетка, получившая фрагмент хромосомной ДНК донора.

Процесс формирования рекомбинантов состоит из нескольких этапов: 1) пресинапса, или узнавания гомо­логичных участков; 2) синапса, или спаривания, перено­симого фрагмента ДНК донора с хромосомой реципиента; 3) собственно рекомбинации, или интеграции; 4) сегре­гации, или выщепления, различных рекомбинантных клонов в процессе клеточного деления.

Рекомбинация участков хромосом или иных репликонов, представленных непрерывными молекулами ДНК, подразделяется на три типа. К первому относится общая, или генерализованная, рекомбинация между молекулами ДНК с протяженными участками гомологии. Обмен гомо­логичными участками в различных точках приводит к появлению новых сочетаний сцепленных генов. Второй тип — сайт-специфичная рекомбинация, осуществляю­щаяся на коротких специализированных последователь­ностях нуклеотидов. Она обеспечивает обмен в основном не гомологичных между собой молекул ДНК. Третий тип — «незаконная» рекомбинация, в результате которой происходят негомологичные обмены.

Трансформация. Процесс трансформации можно разделить на несколь­ко стадий: 1) обратимое присоединение молекул двухцепочечной ДНК к рецепторным сайтам на поверхности клетки реципиента (на этой стадии ДНК донора чувствительна к разрушению ДНК-азой); 2) необратимое погло­щение ДНК донора (с этого времени процессу трансфор­мации нельзя помешать обработкой ДНК-азой); 3) прев­ращение двухцепочечной ДНК донора в одноцепочечные фрагменты под действием клеточных нуклеаз; 4) кова_:лентное присоединение (интеграция) одноцепочечной ДНК донора к хромосоме реципиента; 5) сегрегация и фенотипическая экспрессия интегрированного гена донора (или генов) в рекомбинантной трансформированной клетке.

Важное условие способности клетки к трансформации – развитие у неё особого физиологического состояния, называемого компетентностью. Компетентность можно индуцировать определенными условиями роста клеток.

Условиями, существенными для присоединения ДНК к компетентным клеткам, являются ее размеры (М_r не менее 3 Х 10⁵; по этой причине ДНК, разрушенная ДНК-азой, не обладает трансформирующей активностью) и интактность двухцепочечной структуры. Одноцепочечная ДНК может присоединяться к клеткам, но характери­зуется очень низкой трансформирующей способностью вследствие своей высокой чувствительности к дегради­рующему действию клеточных нуклеаз.

После присоединения трансформирующая ДНК долж­на проникнуть внутрь клетки, чему способст­вует пористость клеточной стенки. Вместе с тем процесс поглощения ДНК донора реципиентной бактерией акти­вен и энергетически зависим. Перед проникновением, но вскоре после присоединения одна из цепей трансформи­рующей ДНК надрезается эндонуклеазой, находящейся в периплазматическом пространстве между стенкой и мембраной. Затем эта же или другая эндонуклеаза при­соединяется к комплементарной неповрежденной нити и делает в ней несколько надрезов. В результате обра­зуются двухцепочечные фрагменты трансформирующей ДНК с максимальным М_r около 10⁷. Далее эти фрагменты подвергаются экзонуклеазной атаке, приводящей к полной деградации одной цепи ДНК и образованию одноцепочечных фрагментов. Именно в такой форме трансформирую­щая ДНК проникает внутрь клетки. Предполагается, что по крайней мере в случае пневмококков эта же экзонуклеаза помогает втаскиванию одноцепочечной донорной ДНК в клетку за счет энергии, высвобождающейся при деградации комплементарной цепи.

Первые три стадии трансформации — присоединение ДНК, ее поглощение и деградация одной цепи — осуще­ствляются с равной эффективностью независимо от ее гомологии с ДНК реципиента. На этом основана возможность конкурентного подавления трансформирующей активности гомологичной ДНК препаратами чужеродной ДНК, например из тимуса теленка или спермы лосося. Однако процесс интеграции, или рекомбинации, ДНК специфичен в отношении гомологичной ДНК и с негомо­логичной ДНК происходит с очень низкой частотой.

Минимальная длина цепочки ДНК, способной интегрировать в реципиентную хромосому, составляет около 500 нуклеотидов. Однако обычно в рекомбинации участ­вуют ДНК донора длиной около 200 тыс. нуклеотидов или 1/200 всей бактериальной хромосомы.

Трансдукция. Трансдукцией называется перенос ДНК из одной клетки (донора) в другую (реципиент) с помощью бактериофагов. Этот способ генетического обмена был открыт в 1952 г. Н.Зиндером и Дж.Ледербергом в отношении штаммов Salmonella и фага Р22. С тех пор возможность трансдукции была подтверждена на различных бактериях и фагах. Различают три типа трансдукции: общую (или неспецифическую, генерализованную), ограниченную (или специфическую) и абортивную.

В случае общей трансдукции фрагменты бактериальной ДНК донора могут случайно включиться в созреваю­щую фаговую частицу вместе с фаговой ДНК или даже вместо нее. Это ведет к образованию трансдуцирующих частиц дефектного фага, утратившего часть своего генома. При таком типе трансдукции в головку фага может упаковываться бактериальная ДНК длиной 1/50—1/100 от всей хромосомы, т.е. имеющая М_r (2,5—5,0) · 10⁷. При ограниченной трансдукции происходит рекомбинация между фаговой и хромосомной ДНК, поэтому фаговые трансдуцирующие частицы обязательно содержат ДНК обоих типов. При абортивной трансдукции трансдуцируемый фагом фрагмент ДНК донора не включается в хромосому клетки-реципиента, а остается в ее цитоплазме и в таком виде способен поддерживаться и проявляться фенотипически. Во время деления этот фрагмент пере­дается только одной из двух дочерних клеток, т.е. насле­дуется однолинейно. В конечном итоге он утрачивается в потомстве, однако с помощью абортивной трансдукции можно установить, относятся ли мутации, контролирую­щие потребность в каком-либо веществе, к разным цистронам или к одному и тому же. т.е. провести цис-транс-тест.

Конъюгация. Основу генетического анализа составляет изучение рекомбинации или перераспределения наследственной информации донорного и реципиентного организмов. Необходимая предпосылка рекомбинации у эукариот — слияние двух гаплоидных гамет с образованием диплоидного ядра – зиготы. Дж.Ледерберг и Э.Татум (1946) обнаружили, что у бактерий также существует половой процесс в форме прямого переноса генетического мате­риала от одной бактериальной клетки (донора) к другой (реципиенту) при их непосредственном контакте. Этот процесс назван конъюгацией. Во время конъюгации от двух до 10 и более донорных и реципиентных клеток обра­зуют агрегаты скрещивания. Их формированию способст­вуют половые ворсинки (пили), находящиеся на наружной поверхности доноров. Втягивание таких ворсинок внутрь донорной клетки после их присоединения к специфичным рецепторам на поверхности реципиента как бы подтяги­вает его к донору и способствует пристеночному контакту конъюгирующих бактерий. Некоторые типы пилей представляют собой полые цилиндры, служащие каналом для переноса ДНК от донора к реципиенту. Как и в случаях трансформации и трансдукции, генетический материал при конъюгации переносится в одном направ­лении — от донорных клеток к реципиентным. Способ­ность бактерий быть донорами при конъюгации определяется присутствием в них внехромосомных ДНК — плазмид особого типа, называемых половыми факторами. Половые факторы несут гены, контролирующие образо­вание пилей и способность к переносу самих этих факто­ров, а также бактериальной хромосомы и (или) других плазмид, не являющихся половыми факторами. Первый половой фактор — плазмиду F (от англ. fertility — пло­довитость) обнаружил У.Хейс (1952). Он выявил, что штаммы Е. соli К12 дифференцированы по половому признаку. Одни, содержащие фактор F, переносят ДНК. Их обозначают как донорные, или мужские. Другие штаммы не несут F-фактор и воспринимают ДНК, передающуюся от донора. Такие штаммы называют реципиентными или женскими.

F⁺ и Hfr-доноры. F-фактор может находиться в муж­ской клетке в двух альтернативных состояниях: в авто­номном, когда он реплицируется независимо от хромо­сомы, и в интегрированном, когда он ковалентно при­соединяется к хромосомной ДНК.

Внехромосомные генетические элементы микроорганизмов. Плазмиды бактерий. В предыдущих разделах неоднократно отмечалось, что генетический материал бактерий представлен не только хромосомой, но и плазмидами. Этим термином, предло­женным Дж.Ледербергом (1952), обозначают репликоны (т.е. единицы генетического материала, способные к не­зависимой репликации), существующие в клетках ста­бильно и автономно от хромосомы. Во многих случаях носительство плазмид для клеток не обязательно и их ут­рата не влияет на жизнеспособность бактерий-хозяев. В других случаях, связанных, например, с изменениями внешней среды, их присутствие в клетке — условие выжи­вания не только отдельной бактерии, но и бактериальной популяции в целом.

Плазмидология — учение о плазмидах — внехромосомных молекулах нуклеиновых кислот, автономно реплицирующихся в цитоплазме клеток. Плазмидоносительство описано у представителей более 40 родов бактерий.

В 1961 г. Р.Лавалле и Ф.Жакоб показали, что плазмиды, как и бактериальная хромосома, чувствительны к распаду ³²Р. Из этого был сделан вывод, что плазмиды представляют собой ДНК. В дальнейшем был разработан способ избирательного выделения плазмидных ДНК с помощью центрифугирования в градиентах плотности СsС1, содержащих краситель бромид этидия, преимущественно вставляющийся в хромосомную, а не в плазмидную ДНК, тем самым позволяя разделить эти молекулы по плотно­сти. Плазмидные ДНК отделяют от хромосомы также с по­мощью электрофореза в агарозном геле и другими мето­дами.

С помощью физических методов показано, что ДНК F-фактора и других бактериальных плазмид представ­ляет собой двухцепочечную ковалентно-замкнутую коль­цевую (КЗК) молекулу, имеющую к тому же сверхскрученную конфигурацию. Молекулы плазмидных ДНК мо­гут объединяться друг с другом в результате рекомбина­ции, приводящей к образованию соединенных друг с другом колец — конкатомеров либо коинтегратов двух плаз­мид в виде одной крупной молекулы в КЗК-форме. Пред­полагается, что сверхскрученная КЗК-форма плазмидных ДНК существенна для их стабильного наследования, возможности переноса путем конъюгации и трансформации, а также транскрипции. Помимо КЗК-форм плазмидные ДНК представлены в клетке некоторым количеством от­крытых кольцевых и линейных структур, являющихся про­межуточными продуктами репликации.

Встречающиеся в природных условиях бактериальные плазмиды значительно варьируют по размерам. М_r наибо­лее мелкой из известных — плазмиды в штамме Е. Соli N15 — составляет около 1,5 • 10⁶. Это достаточно для кодирования всего лишь двух белков средней величины, воз­можно, участвующих в репликации плазмидной ДНК. М_r ДНК плазмиды F~65·10⁶, длина молекулы, содержащей около 100 000 п.н., 30,8 - 31,7 нм. Примерно такие же величины характеризуют размеры и других плазмид — половых факторов. Известны, однако, и более крупные плазмиды. Так, в штаммах ризобий обнаружены плазмиды с М_r до 600 • 10⁶, т.е. равные по величине почти 1/4 длины всей хромосомы.

Плазмиды эукариотических микроорганизмов. Плазмидоподобные структуры обнаружены у некото­рых эукариотических микроорганизмов. Примером может служить ДНК дрожжей Saccharomyces cerevisiae разме­ром 2 или 3 мкм. ДНК размером 3 мкм представляет собой автономно реплицирующуюся кольцевую молекулу, несу­щую рибосомные гены. Предполагается, что такие структуры могут «корректировать» концевые нехватки либо делеции хромосом, содержащих гены рРНК. ДНК размером 2 мкм, называемая также омикрон-ДНК, или О-ДНК, име­ет М_r около 4 · 10⁶ и разделена на две половины инверти­рованными повторами, состоящими примерно из 600 п.н. Она используется как эффективный вектор в работах по клонированию различных генов в дрожжах.

У этого же вида дрожжей известны плазмидоподобные частицы V1 и V2, являющиеся двухцепочечной РНК (это один из немногих примеров того, что плазмиды могут быть образованы РНК) и называемые факторами-убийцами (англ. killer — убийцы). Клетки дрожжей, несущие обе эти частицы, выделяют токсин, убивающий другие клетки, в которых находится только V1, либо отсутствуют обе частицы. Репликация частицы V2 невозможна без частицы VI. В то же время репликация и поддержание (т.е. ста­бильное существование и наследование) обеих частиц за­висят от функционирования по крайней мере десяти ядер­ных генов.

У дрожжей и других грибов описаны также внеядерные плазмидоподобные элементы, несущие детерминанты ус­тойчивости к антибиотикам и необходимые для функцио­нирования митохондрий.

Приведенные примеры показывают, что цитоплазматические детерминанты наследственности, или «плазмагены» эукариотических микроорганизмов, подобно плазмидам бактерий, могут функционально взаимодействовать с ядерным геномом, усиливая генетический потенциал клетки-хозяина.

Мигрирующие генетические элементы микроорганизмов. IS-элементы и транспозоны бактерий. О мигрирующих генетических элементах (МГЭ) уже упоминалось при рассмотрении проблемы спонтанного мутагенеза и структурной организации плазмид. К МГЭ относятся IS-элементы (от англ. insertion — вставочные последовательности) и транспозоны способные к перемещению (транспозиции) в пределах одной молекулы ДНК либо из одной молекулы ДНК в дру­гую. МГЭ опосредуют рекомбинацию между негомологич­ными ДНК, в которых эти элементы находятся, а также обусловливают интеграцию плазмиды с хромосомой. Общая длина IS-элементов в среднем составляет 700-1500 п.н. Они не содержат генов, не связанных собственно с про­цессом транспозиции, но несут на концах инвертирован­ные повторы длиной 8-40 п.н. Число IS-элементов в геноме различных видов бактерий и даже отдельных бакте­риальных штаммов колеблется от 0 до 20.

IS-элементы имеют три важных свойства: 1) при пере­мещениях могут инактивировать гены или нарушить их регуляцию; 2) способны индуцировать все виды хромосом­ных перестроек — нехватки, дупликации, инверсии, транслокации, слияние и разрывы репликонов; 3) могут приво­дить к образованию транспозонов.

В отличие от IS-элементов транспозоны, или Тn-элементы, состоят из генов, необходимых для собственно транспозиции, из структурных генов, определяющих функ­ции, не связанные с самим процессом транспозиции, и из концевых прямых либо инвертированных повторов в виде IS-элементов или иных, более коротких последовательно­стей, необходимых для транспозиции. Входящие в состав транспозонов структурные гены кодируют устойчивость к разным антибиотикам, солям металлов, реже это могут быть гены утилизации некоторых источников углерода, синтеза токсинов и др. Один и тот же транспозон иногда может содержать целый набор генов резистентности. Включившись в состав конъюгативных либо неконъюгативных, однако мобилизуемых плазмид, такие транс­позоны быстро распространяются в природе и особенно в больничных условиях, что препятствует эффективному использованию многих антибиотиков в лечебных целях.

Транспозонсодержащие плазмиды переносятся меж­ду клетками не только путем конъюгации, но и трансфор­мации in vivo, т.е. в организме животных. В этом случае повышается вероятность межвидового перемещения плаз­мид, причем структурные гены транспозонов обычно спо­собны проявляться в новых хозяевах. Создается основа для включения гомологичных генов в состав плазмид и хромосом различных неродственных бактерий. В этом процессе могут участвовать и трансдуцирующие фаги. Помимо собственных генов МГЭ их функционирование регулируется рядом генов бактерий, присутствующих в плазмидах или в хромосоме. Некоторые из этих генов влияют на точное вырезание транспозонов, другие — на ин­дукцию делеций, обусловленную IS и Tn-элементами, тре­тьи — на частоту транспозиции.

Общая особенность всех МГЭ — образование дупликаций из 5-12 коротких нуклеотидных последователь­ностей в местах их внедрения. Подобные дупликации про­исходят вследствие удвоения участка ДНК, в который вставляется МГЭ. Размер дупликации специфичен для каждого IS- или Tn-элемента и определяется структурой их концевых инвертированных повторов. В основе таких дупликаций лежат «ступенчатые» разрывы цепей ДНК в сайтах-мишенях. Встраивание внутрь этого перекрываю­щегося участка МГЭ приводит к формированию одноцепочечных брешей строго определенного размера, которые затем достраиваются репаративной системой. Это ведет к появлению дупликации, внутри которой встроен МГЭ.

Вопросы

1. Какова роль исследований по генетике микроорганизмов в развитии биологии?

2. Каковы структура и функция эукариотических и прокариотических микроорганизмов?

3. В чём отличие вирулентных и умеренных фагов?

4. Что такое трансформация? Возможна ли трансформация у высших организмов?

5. Что такое трансдукция?

6. Что такое коньюгация?

7. Что изучает плазмидология?

8. Какова роль транспозонов и IS-элементов?

ЛЕКЦИЯ 16