Генетическая инженерия

1. Искусственный синтез белков.

2. Выделение генов и включение их в вектор.

3. Некоторые результаты опытов по трансгенозу.

4. Генетическая инженерия на уровне хромосом и геномов.

Яркой иллюстрацией совершенно новых возможностей, открываемых современной генетикой для целенаправленной переделки наследственности организ­мов, служат достижения генетической инженерии — отрасли, бурно развиваю­щейся в последние десять лет.

Генетической инженерией называют прикладную молекулярную и клеточную генетику, разрабатывающую прие­мы экспериментального вмешательства, позволяющего по заранее намеченному плану перестраивать геном организмов, изменяя содержащую в нем генетиче­скую информацию. При этом в понятие генетической инженерии не включают перестройку геномов обычными генети­ческими методами, т.е. искусственным вызыванием мутаций и получением ре­комбинаций путем скрещивания. К ге­нетической инженерии принято отно­сить следующие операции:

1) синтез генов вне организма;

2) выделение из клеток отдельных генов или генетических структур (фраг­ментов хромосом, целых хромосом или даже целых клеточных ядер);

3) направленную перестройку выде­ленных структур;

4) копирование и размножение вы­деленных или синтезированных генов или генетических структур;

5) перенос и включение таких генов или генетических структур в подлежа­щий изменению геном;

6) экспериментальное соединение разных геномов в одной клетке.

В ходе многочисленных экспериментальных работ, проведенных по этим разделам, получены важные новые сведения о структуре геномов, репликации генов и хромосом, механизмах пере­стройки хромосом, переносе генетической информации. Таким образом, ис­следования в области генетической инженерии оказались весьма плодотворными и в познавательном отношении. Вместе с тем результаты этих исследо­ваний позволили дать обоснованные прогнозы того, что может дать в буду­щем для человечества дальнейшее раз­витие генетической инженерии. Так можно предвидеть, что такие работы во много раз увеличат эффективность мик­робиологического производства кормо­вых белков, витаминов, антибиотиков и других биологически активных веществ; в хромосомы сельскохозяйствен­ных растений будут перенесены гены азотфиксирующих бактерий, вследствие чего растения приобретут способность усваивать молекулярный азот атмо­сферы и отпадет нужда в азотных удоб­рениях; будут найдены способы ради­кального лечения наследственных бо­лезней человека. Предсказываются и другие ценные практические результа­ты, к которым должна привести генети­ческая инженерия. Наряду с этим, нельзя закрывать глаза на то, что генетическая инженерия может привести и к результатам, опасным для человека. При объединении разнородных генов могут возникнуть молекулы ДНК с непредсказуемыми свойства­ми. Особенно опасны опыты, которые могут привести к появлению форм болезнетворных бактерий, устойчивых к антибиотикам и другим медикаментам, а также опыты с вирусами, вызывающими злокачественные опухоли. Сейчас разработаны меры и ученые разных стран договорились на ряде международных совещаний об их обязательном применении. К числу таких мер, помимо обычно используемых в работах с болезнетворными микробами и вирусами, относится рекомендация экспериментировать только с микроба­ми и вирусами, не способными размно­жаться в организме человека. Предла­гается, например, пользоваться мутантными штаммами кишечной палочки, нуждающимися в питательных средах, содержащих вещества, отсутствующие в кишечнике человека, и мутантными вирусами, неспособными реплицироваться при температуре человеческого тела.

Первые указания на то, что чужая генетическая информация может быть искусственно внесена в несодержащий ее организм и приживлена там, были получены в работах с двумя разными вирусами: вирусом табачной мозаики (ВТМ), геном которого состоит из РНК, и с вирусом папилломы Шоупа, геном которого состоит из ДНК.

С помощью фермента полинуклеотидфосфорилазы к РНК ВТМ была пришита полиадениловая кислота, т.е. синтетический полинуклеотид, состоящий из многократных повторов аденина. Согласно таблице генетического кода, триплеты аденина кодируют аминокислоту лизин. Этой РНК заразили листья табака и там она вызвала синтез полилизина, т.е. полипептида, построенного из одних лизинов. Этот опыт показал, что «синтетическая генетическая информация», пришитая к вирусной РНК, используется клеткой.

Вирус папилломы Шоупа вызывает в эпителиальных и печеночных клетках кролика синтез аргиназы – фермента, разрушающего аминокислоту аргинин. Кролики, которым введет этот вирус, имеют низкий уровень аргинина в крови, даже если у них не развились бородавки, обычно наблюдаемые при таком заражении. У лиц, работавших с вирусом Шоупа в лаборатории, а также у самого Р.Шоупа, открывшего этот вирус и вспрыснувшего его себе, не появилось никаких патологических симптомов, но содержание аргинина в крови у них было значительно ниже свойственного людям, не зараженным этим вирусом, и это состояние сохранилось в течение многих лет после прекращения контактов с вирусом Шоупа. У человека известно редкое наследственное заболевание аргининемия, ха­рактеризуемое высокой концентрацией аргинина в крови, резкой умственной отсталостью, эпилепсией, расстройства­ми обмена. Если бы аргининемию обна­руживали у ребенка достаточно рано, вероятно, можно было бы предотвратить эти патологические проявления введением в организм безвредного для человека вируса Шоупа.

К генетической инженерии, бесспор­но, относятся манипуляции по направленному изменению генетической информации клетки или организма. Их можно разделить на две главные категории. Одна из них — трансгеноз, т.е. экспериментальный перенос выделен­ных из генома или искусственно синтезированных генов в другой геном; та­кие работы составляют большинство. К другой категории относится экспери­ментальный перенос выделенных из клетки хромосом в другую клетку или экспериментальное соединение в одной клетке разных геномов.

Трансгеноз состоит из трех основных последовательно выполняемых опера­ций. Сначала выделяют или синтезиру­ют ген или гены, подлежащие переносу. Затем этот ген или гены включают в вектор, т.е. в такую автономно реплицирующуюся генетическую структуру, с помощью которой этот ген или гены могут быть размножены и введены в клетку-реципиент, наследственные свой­ства которой желают изменить. И, на­конец, создают условия для проникновения вектора с включаемыми в него генами в эту клетку, где они встраива­ются в ее хромосомный аппарат или автономно реплицируются в составе вектора.

Искусственный синтез генов. В сов­ременной генетике применяются два способа искусственного синтеза генов вне организма — химический и ферментативный. Впервые синтез гена был осу­ществлен химическим путем в 1969 г. работающим в Америке индийским уче­ным Хораной с сотрудниками. Этим рукотворным геном был небольшой по размеру (77 пар нуклеотидов) ген аланиновой тРНК дрожжей, последова­тельность нуклеотидов в котором была к тому времени полностью расшифрова­на. Руководствуясь этой последовательностью, группа Хораны химически син­тезировала мелкие фрагменты ДНК (от 4 до 13 пар нуклеотидов) и соединила их в нужном порядке с помощью лигазы. Изготовленный таким образом ген не имел регуляторных элементов и был функционально неактивным.

Развивая это направление и приме­няя те же методы, Хорана со своими помощниками синтезировали в 1976 г. отрезок ДНК кишечной палочки, содержащий ген супрессорной тирозиновой тРНК длиной 126 пар нуклеотидов, и примыкающие к нему промотор (52 па­ры нуклеотидов) и терминатор (21 пара нуклеотидов), а также прикрепленные к концам отрезка тетрануклеотиды ААТТ и ТТАА. На этот раз искусственно созданный ген вместе с этими добавочными элементами оказался полностью работоспособным, что проявилось, когда синтезированный отрезок был встроен в геном мутантного фага Т4. Этот фаг содержал нонсенсмутацию, вследствие которой в транс­крибируемой с его генома матричной РНК триплет УАЦ, кодирующий ти­розин, превратился в УАГ т.е. в стоп-сигнал, обрывающий рост полипептидной цепи, почему этот мутантный фаг не может размножать­ся в нормальных клетках кишечной палочки. В присутствии такой тРНК происходит по­давление (супрессия) нонсенс-мутации фага Т4 и он приобретает способность размножаться в нормальных бактери­альных клетках, что и произошло после встраивания в геном мутантного фага искусственно синтезированного отрез­ка ДНК с геном супрессорной тирозиновой тРНК.

Другим примером искусственного создания функционально-активного ге­на служит химический синтез неодно­кратно упоминавшегося в лекциях оператора лактозного оперона кишеч­ной палочки. Синтезированный в про­бирке оператор был встроен в плазмиду, с помощью которой его удается ввести в бактерию. Когда в бактерию, у которой лактозный оперон заблоки­рован вырабатываемым в ней репрессором, вводят одновременно несколько таких плазмид, несущих искусственно синтезированные операторы, то коли­чества образуемого в клетке репрессора не хватает, чтобы связаться со всеми оказавшимися в ней операторами лак­тозного оперона. Оперон этот дерепрессируется, его структурные гены начи­нают работать, обеспечивая синтез ко­дируемых ими ферментов, и кишеч­ная палочка приобретает способность усваивать лактозу.

Эти блестящие результаты, достиг­нутые длительной кропотливой работой, показали возможность создания в про­бирке генов, вполне тождественных природным, однако следует отметит, что синтезированные гены относятся к наиболее мелким из известных; изго­товление же генов, кодирующих белки и состоящие из тысячи или более нуклеотидных пар, пока представляют для химического метода слишком сложную задачу. Искусственный синтез таких генов стал возможен благодаря откры­тию обратной транскрипции с РНК на ДНК. Изучение транскрипции показало, что матрицей для образования ДНК-вых копий может служить не только РНК онкогенных вирусов, в опытах с которыми это явление было открыто, но и разные другие РНК, в том числе даже синтетические полирибонуклеотиды. Обратная транскриптаза добросовестно строит на всех таких матрицах их ДНК-копии. Это сделало принципиально осуществимым искус­ственный ферментативный синтез лю­бых индивидуальных генов (притом в числе копий) путем транскрибирования их с соответствующих РНК.

Выделение генов и включение их в вектор. Химическим путем пока что удается синтезировать только очень небольшие гены, вроде генов транспорт­ных РНК, а посредством обратной транскрипции синтезируются, большей частью, лишь структурные гены без необходимых для их функционирова­ния регуляторных элементов. Это огра­ничивает использование искусственно синтезированных генов для целей ге­нетической инженерии и трансгеноз ча­ще осуществляют природными генами, тем или иным способом выделенными из генома.

Впервые гены удалось выделить в 1969 г. американскому ученому Дж. Беквитсу с сотрудниками. Они вос­пользовались тем, что два разных трансдуцирующих фага при размноже­нии в кишечной палочке могут захватывать и встраивать в свой геном лактозный оперон бактерии вместе с примы­кающим к нему геном-регулятором, причем данный отрезок бактериальной хромосомы встраивается в геном этих двух фагов в противоположной ориен­тации

Векторами чаще всего служат мелкие кольцевые бактериальные плазмиды, несущие гены устойчивости к тому или иному антибиотику или к ультрафиолетовому свету. Широко пользуют­ся также мутантным фагом лямбда, значительная часть генома которого выпала вследствие делеции. Для пере­носа генов в клетки млекопитающих особенно пригоден онкогенный обезья­ний вирус ОВ40. Геном этого вируса обладает способностью встраиваться в хромосомы клеток млекопитающих и кроме того этот вирус иногда превра­щается в псевдовирион, в котором внут­ри вирусного белкового капсида нахо­дится не вирусная ДНК, а захваченный вирусом кусок ДНК хромосомы хозяй­ской клетки, где вирус реплицировался.

В опытах по трансгенозу наиболее употребительны методы, позволяющие изучать отрезки ДНК с «липкими концами», т.е. содержащие на концах последовательности нуклеотидов, образую­щие комплементарные пары с тем отрезком ДНК, с которым их хотят соединить.

Чаще всего отрезки ДНК получают с помощью рестриктаз; это эндонуклеазы, разрезающие нить ДНК в строго определенных местах — там, где нуклеотиды расположены в порядке, опо­знаваемом этой рестриктазой.

В настоящее время самый распрост­раненный метод получения фрагментов ДНК с подлежащим переносу геном - это так называемый способ дробового ружья (shot-gun), заключающийся в том, что ДНК механически или рестриктазами дробят на многочисленные мелкие фрагменты и затем их вслепую гибридизируют с молекулами ДНК вектора, обработанными рестриктазой для превращения их в линейные и для при­дания им липких концов. Образовав­шиеся гибридные молекулы вводят в кишечную палочку и дальнейшая зада­ча заключается в отыскании и выделении тех бактерий, в которые попал фрагмент ДНК с нужным геном.

Некоторые результаты опытов по трансгенозу. Работы по трансгенозу имеют существенное теоретическое значение и позволяют хотя бы ориентировочно оценивать перспективы для практики.

Примером трансгеноза может служить рекомбинация, одна из которых несла ген устойчивости к тетрациклину, а другая – к стрептомицину. Полученная рекомбинантная плазмида имела оба эти гена, и когда ее ввели в кишечную палочку, придала ей устойчивость к обоим антибиотикам.

Ряд работ посвящен переносу генов из бактерии в бактерию из азотфиксирующей бактерии группа генов, определяющих это ее свойство, была перенесена в кишечную палочку, после чего кишечная палочка приобрела способность фиксировать атмосферный азот. Методы генетической инженерии уже используются для производства вакцин против вирусных болезней.

В ряде исследований осуществлен перенос генов бактерий в клетки эукариотов. Американский ученый Г.Финк с помощью рекомбинантной плазмиды ввел в клетки штамма дрожжей, ауксотрофного по лейцину, бактериальный ген, кодирующий синтез этой аминокис­лоты. Ген этот встроился в геном дрож­жей и превратил их в прототрофные. Широко известны опыты другого аме­риканского ученого П.Меррила с со­трудниками, которые с помощью фага лямбда перенесли ген галактозо-1-фосфат-уридилтрансферазы кишечной па­лочки в культивируемые вне организма клетки человека, больного галактоземией, что обеспечило синтез этого фермента клетками, т.е. излечило их.

Важные результаты дали опыты по переносу векторными молекулами ге­нов эукариотов в клетки бактерий. Так, ген имидазолглицерофосфатдегидрогеназы (фермента, участвующего в синтезе гистидина) дрожжей был введен в ки­шечную палочку, дефектную по данно­му гену. Также в кишечную палочку были введены гены гистонов морского ежа (о чем уже упоминалось выше), гены рибосомных РНК шпорцевой ля­гушки и дрозофилы, многие другие гены дрозофилы, структурный ген глобина кролика, гены инсулина крысы, мыши и человека, гены митохондриальной ДНК мыши и ряда других. В боль­шинстве случаев, хотя и не всегда, было установлено, что гены эукариотов нор­мально транскрибируются в клетках бактерии — там синтезируются соответ­ствующие этим генам мРНК и даже эукариотные белки. Особенно важно, что введение генов эукариотов в бак­терии может быть использовано для микробиологического синтеза некото­рых биологически-активных веществ, нормально продуцируемых не бакте­риями, а клетками высших организмов, откуда их подчас трудно извлекать. Так, например, был синтезирован гормон соматостатин млекопитающих. Этот гормон, молекула которого состоит из 14 аминокислот, образуется в очень небольших количествах в гипоталамусе и регулирует поступление в кровь гормона роста и инсулина. Кодирующий соматостатин ген был синтезирован вне организма и состыкован со встроенным в плазмиду бактериальным геном бета-галактозидазы, в том числе и с регуляторными элементами соответствующего оперона. Реконструированные плазмиды затем ввели в клетки кишечной палочки и после размножения этих бактерий из них было выделе­но 5 мг соматостатина (для получения такого количества этого гормона из гипоталамуса пришлось бы перерабо­тать 500 тысяч бараньих мозгов). В другой работе искусственно созданные вне организма гены, кодирующие две полипептидные цепи, образующие инсу­лин человека, были сходным методом встроены в клетки кишечной палочки, которые вследствие этого приобрели способность синтезировать этот гормон, очень нужный практической медицине.

Близкими в принципе генетико-инженерными методами были синтезированы и введены в клетки кишечной палочки гены, кодирующие синтез ряда других лекарственных препаратов, быв­ших прежде остро дефицитными и труд­но добываемыми: человеческого интерферона (служащего для лечения ряда вирусных болезней и перспективного в качестве противоопухолевого средства), брадикинина и ангиотензина (регулирующих кровообращение), эндорфина (нервного медиатора, снимающего боль, но не вызывающего привыкания), гормона роста человека (необходимого для лечения некоторых форм врожденной карликовости), гормона роста домашних животных и т.д. Производство некоторых из этих веществ обычными, не генетико-инженерными методами, настолько дорого и сложно, что ими почти не пользовались; например, гор­мон роста человека получают из труп­ных гипофизов, где он содержится в таком ничтожном количестве, что для лечения одного ребенка требуется ис­пользовать гипофизы тысяч покойни­ков. Теперь генетическая инженерия открыла перед медицинской промыш­ленностью дорогу для относительно дешевого, простого и высокоэффектив­ного микробиологического производства этих препаратов. Число лекарственных веществ, над генетико-инженерным синтезом которых ведется работа, непрерывно возрастает и можно быть уверенным, что ближайшие годы принесут в этой области новые достижения.

Генетическая инженерия на уровне хромосом и геномов. Относимые к генетической инженерии работы по экспериментальному переносу хромосом из одной клетки в другую и по соединению в клетке разных геномов тесно смыкаются с преследующими эти же цели работами, проводимыми с помощью обычных генетических методов (напомним перенос отдельных хромосом и их частей при гибридизации растений, использование транслокаций для регулирования пола у шелкопряда, пересадку соматических ядер в яйцеклетку, из которой удалено ядро, получение аллофенных животных и т.п.). Поэтому разграничение этих двух типов работ до известной степени условно.

В ряде исследований, проведенных на культурах клеток животных, установлено, что выделенные из клетки метафазные хромосомы могут внедряться в другую клетку путем пиноцитоза и, таким образом, передавать гены клетки-донора в клетку-реципиент. Метод пересадки ядер соматических клеток в энуклеированные яйце­клетки перспективен для животноводства. Генотип животных, особенно выдающихся по своим хозяйственно-ценным признакам, сейчас стараются со­хранить и размножить посредством скре­щиваний. При этом у потомков неизбежно нарушается удачное сочетание генов, определявшее высокие качества исходного животного.

Разработанные к настоящему времени приемы позволяют извлекать неоплодотворенные яйцеклетки млекопи­тающих, пересаживать в энуклеированные яйцеклетки диплоидные ядра сома­тических клеток и вводить зиготу в матку самки, гормонально подготовленную к имплантации; так, например, у мышей удалось этим способом получить потом­ков из энуклеированных яйцеклеток, в которых вводили ядро соматической клетки другой особи. При том удалось даже клонировать особь, у которой бра­ли ядра для пересадки, т.е. получить группу потомков, генетически вполне тождественных этой особи. Успех по­добных опытов дает основание предполагать, что в недалеком будущем та­ким способом можно будет получать от ценного сельскохозяйственного жи­вотного, выделяющегося по своей про­дуктивности (например, от коровы или свиньи-рекордистки) неограниченное число потомков, обладающих точно таким же генотипом, как это животное, что может иметь важное значение в племенном животноводстве.

В последние годы быстро развива­ются работы по гибридизации соматических клеток. Для повышения частоты слияния двух или нескольких клеток животных их обрабатывают инактивированньм вирусом Сендай; клетки же растений предварительно превращают в протопласты, разрушая клеточные стенки пектиназой и целлюлазой, а для облегчения слияния протопластов на них действуют полиэтиленгликолем или некоторыми другими веществами.

С помощью гибридизации соматических клеток получены ценные сведения по ряду генетических проблем. Особенно широко этот метод применя­ется для картирования генов человека. Обычными генетическими приемами можно установить, в какой хромосоме лежит тот или иной ген только в том случае, если найден мутантный аллель этого гена. Гибридизация соматических клеток позволяет решить этот вопрос и для немутантных генов человека. Для этого используют гибридные клетки че­ловек X мышь и человек X китайский хомячок. Во многих случаях "гибридные линии кле­ток выделяют с помощью селективных сред, на которых родительские клетки погибают, а выживают и образуют колонии только гибридные. В процессе дальнейшего размножения' гибридных клеток в них постепенно теряются хро­мосомы человека — именно это обсто­ятельство позволяет определить, в какой хромосоме локализован изучаемый ген. Здесь опять пользуются особыми селективными средами, на которых выживают только те гибридные клетки, в которых имеется этот ген.

Гибридизация соматических клеток открывает новые возможности для изучения закономерностей регуляции действия генов в ходе онтогенетической дифференциации клеток. Большинство таких работ выполнено на клетках позвоночных.

Метод переноса генов с помощью ДНК может оказаться в будущем весь­ма ценным для практической медици­ны. Об этом свидетельствуют некото­рые опыты, проведенные на лаборатор­ных животных, а также попытки использования этого метода для лечения человека.

Все эти методь могут быть использованы для конструирования новых форм микроорганизмов, животных и растений путем введе­ния и стабильного наследования в них рекомбинантных ДНК, несущих гены, детерминирующие желаемые при­знаки.

Не менее важное значение имеет генная инженерия в качестве мощного инструмента фундаментальных иссле­дований. С ее помощью изучают строение различных геномов, отдельных генов и кодируемых ими продуктов. Генная инженерия помогла раскрыть экзон-интронную организацию эукариотических генов, позволила понять суть явления непостоянства генома, связанного с при­сутствием мигрирующих генетических элементов у про- и эукариот, открыла принципиально новые возможности для изучения молекулярных основ онтогенеза, наслед­ственных заболеваний, эволюционного происхождения различных организмов. В значительной мере этим успехам генной инженерии способствовало создание банков (или библиотек) генов отдельных организмов, резко облегчаю­щих стратегию поиска индивидуальных генов, исследо­вание их структуры и функции. Получение банков генов включает выделение тотальной ДНК, фрагментацию ее с помощью рестриктаз, присоединение полученных фрагментов к векторным молекулам (плазмидного или фагового происхождения) и введение рекомбинантных ДНК в реципиентные бактерии. Эта техника позволяет полу­чить набор клонов бактерий или гибридных фагов, различающихся по включенным фрагментам ДНК. Необ­ходимые исследователю гены отбирают из таких банков с помощью специально разработанных генетических, био­химических, радиоизотопных и иммунологических методов. Уже в 1974 г. Д. Хогнесс с сотрудниками создали банк генов D. melanogaster в клетках Е. coli. Вскоре был получен полный банк генов Е. соli, а затем и многих других организмов, включая человека. Последнее откры­вает реальные перспективы для генотерапии наследствен­ных заболеваний человека с целью исправления генети­ческих дефектов.

Потенциальные возможности генной инженерии дейст­вительно очень велики, и их реализация в полной мере дело сегодняшнего дня и ближайшего будущего.

Вопросы

1. Существует ли разница между генной и генетической инженерией?

2. Какие методы используются в генной инженерии?

3. Каким способом искусственно синтезируются гены?

4. Каковы результаты опытов по трансгенозу?

5. Какие успехи достигнуты методами генетики соматических клеток?

6. Что такое банк генов?