Результати визначення активності ферменту орто-дифенолоксидази фотоколориметричним методом

№ п/п	Дослідний зразок	Величина Екстинції	Активність ферменту	Якість продукту
1
2

Завдання 4 Визначення активності ферменту пероксидази

Пероксидаза виконує велику роль в процесі дихання рослин. Субстратом цього ферменту є поліфеноли у вільному стані або у формі різноманітних з'єднань (глікозидів, дубильних речовин) і ароматичні аміни. Окислення цих речовин фермент здійснює за допомогою перекису водню або яких-небудь органічних перекисів, в тому числі перекисів ненасичених жирних кислот і каротину.

Крім того, пероксидаза деяких рослин, зокрема хрону, є одним із основних реагентів в сучасних імунофлюоресцентних методах дослідження в товарознавстві продовольчих товарів та суміжних з ними галузей науки при необхідності візначення молекулярних складових речовин, білків, їх динамічних змін, або присутності патогенних мікроорганізмів.

Прилади. Фотоелектроколориметр ФЕК-56-М чи КФК-3; аналітичні терези; центрифуга; секундомір.

Обладнання. Піпетки на 2 мл або дозатори піпеточні на 1000-2000 мкл, мірні колби на 25 або 50 мл; порцелянова ступка скляна воронка з тонким стеблом; скляний порошок, хімічні склянки на 1000, 200, 10 мл, скляні палички оплавлені з одного кінця.

Реактиви. Ацетатний буфер з рН 4,7; розчин бензидину на ацетатному буфері;

Дослідні матеріали яблука, клубні картоплі, огірки, тощо.

Хід виконання роботи

1.Приготування розчинів та реактивів

а) Ацетатний буфер з рН 4,7. У хімічний стаканчик внести 54 мл 0,2 М розчину ацетату натрію СНзСООNа ЗН2О й 46 мл 0,2 М розчину оцтової кислоти й ретельно перемішати скляною паличкою.

б) Розчин бензидину на ацетатному буфері. У мірну колбу місткістю 200 мл внести 100 мл дистильованої води і 2,3 мл крижаної оцтової кислоти. Перемішати. Після перемішування до суміші додати 184 міліграм бензидину. Колбу нагрівати на водяній бані при 60 °С, постійно збовтуючи вміст для розчинення бензидину. Після повного його розчинення в колбу внести 5,45 г оцтовокислого натрію. Розчинити оцтовокислий натрій. Вміст колби охолодити і довести дистильованою водою до мітки.

в) 3%-ний розчин перекису водню. У мірну хімічну склянку, місткістю 100 мл внести 96 мл дистильованої води, додати 3 мл перекису водню й ретельно перемішати.

2.Порядок проведення аналізу

Наважку рослинного матеріалу масою 0,2—0,5 г тонко розтерти у порцеляновій ступці з 4 – 5 мл ацетатного буфера з рН 4,7. Перенести (без втрат) в мірну колбу місткістю 25 або 50 мл. Вміст колби довести ацетатним буфером до мітки і ретельно перемішати. Витримати розчин при кімнатній температурі 10 хв. Після цього витяжку центрифугувати 10 хв. при 3000 обертах/хв. Відібрати піпеткою надосадокову рідину для визначення активності ферменту.

Рекомендується брати таке розведення наважки продукту, щоб зміна забарвлення рідини в дослідній кюветі відбувалася за 20—50 с.

У дві кварцові кювети завтовшки 2 см внести по 2 мл ферментного розчину, 2 мл розчину бензидину і по 2 мл ацетатного буферу. Визначення здійснювати на ФЕКу при червоному світлофільтрі в тому ж порядку, як і при визначенні ферменту орто-дифенілоксидази. Спочатку стрілку гальванометру при відкритому світлофільтрі встановити на нульову точку, потім правим барабаном відвести стрілку гальванометру в праве крайнє положення так, щоб екстинкція була рівна 0,125 або 0,250. У ліву (контрольну) кювету внести піпеткою 2 мл води. У праву (дослідну) – кіювету внести піпеткою з широким 2 мл 3% розчину перекису водню. З внесенням першої краплі перекису водню включити секундомір. Розчин в дослідній кюветі набирає блакитне забарвлення. Стрілка гальванометра починає рухатися до нульової точки з швидкістю, яка залежить від активності ферменту. У момент досягнення стрілкою нульової поділки секундомір виключають й визначають час протікання реакції в секундах.

Активність ферменту розраховують за тією ж формулою, що й для розрахунку активності ферменту орто-дифенілксидази.

Завдання 5. Ознайомитись з методами визначення кількості білка з допомогою спектрофотометра

В ході досліджень постійно виникає необхідність визначати наявність та концентрацію білка в продуктах, сумішах а також при вивченні впливу розроблених продуктів на організм споживачів

Визначення кількості білка в УФ-променях засноване на поглинанні світла присутніми в білці амінокислотами: триптофаном, тирозином й, у меншій мірі, фенілаланіном. Максимум поглинання триптофану в УФ-ділянці спектру – при 257 нм, а тирозину – при 294 нм. Вимірювання звичайно проводять при 280 нм.

Оскільки вміст триптофану й тирозину в білках сильно варіює, коефіцієнт поглинання, виражений як Е , також значно варіює. В більшості індивідуальних білків величина Е лежить в інтервалі 0,4 – 1,5, але існують білки з коефіцієнтами поглинання рівними 0 (наприклад, Са+2-зв’язуючі білки).

Коефіцієнти поглинання деяких імунохімічно значущих білків, які використовуються в сучасних іммунобіологічних методах дослідження в товарознавстві продовольчих товарів, наведені в таблиці 6.4.

Як правило, для визначення оптичної щільності розчинів застосовують однопроменеві неавтоматичні спектрофотометри, призначені для вимірювання коефіцієнта пропускання або оптичної щільності рідких, твердих прозорих чи газоподібних речовин в ультрафіолетовій, видимій та близькій до інфрачервоної ділянках спектру.

Принцип дії спектрофотометра заснований на тому, що монохроматичне світло з довжиною хвилі λ1 спочатку пропускають через розчинник, оптичну щільність якого приймають рівною нулю, а пропускання – 100 %, а потім – через розчин дослідного зразка. Для роботи у видимій і близькій до інфрачервоної областях спектру (визначення білка по Лоурі) існує лампа накалювання яка випромінює в області довжин хвиль 320 – 1100 нм.

Джерелом ультрафіолетового світла слугує газорозрядна дейтерієва лампа, що генерує світло з довжинами хвиль 186 – 350 нм. У приладі використовується два фотоелементи: сурьмяно-цезієвий (Ф) – область спектру 186—650 нм і киснево-цезієвий (К) – 600 – 1100 нм. Відношення сигналу, який реєструється фотоелементом від світлового потоку I, що пройшов через зразок, до сигналу світлового потоку Іо, пропущеного через розчинник, визначають за шкалою відліку потенціометра у відсотках пропускання Тλ = І/Іо100 % або як оптичну густину А λ = lg 1/Т λ,. У кількісних вимірюваннях сліду враховувати, те, що при великій (>0,7) та малій (<0,2) оптичній щільності (А λ) точність істотно зменшується. Усунути цей недолік можна, підібравши таке розведення розчинів або товщину кювети, щоб покажчики шкали не виходили за межі 0,2–0,7.

До найбільш широко вживаних методів визначення білка відносяться біуретовая реакція, метод Лоурі, вимірювання оптичної щільності розчинів в ультрафіолетовому світлі, зв’язування фарбників. Характеристика методів визначення білка наведена в таблиці 6.5.

Таблиця 6.4.