Коефіцієнти екстинції деяких імунохімічно значущих білків для практичної та науково-дослідної роботи в товарознавстві продовольчих товарів і суміжних з ним галузях наук.

Білок	Коефіцієнт екстинції (Е )
	Людина	Кролик
IgG	13,6	13,5
IgM	11,8	–
IgA	13,2	–
IgA (секреторний)	12,6	13,5
IgD	17,0	–
IgE	15,3	–
γ- ланцюг	–	13,7
μ - ланцюг	13,9	–
ά – ланцюг	15,5	–
Легкий ланцюг	12,8	11,8
j – ланцюг	6,8	–
Секреторний компонент	12,7	–
Fab	–	15,0
Fc	–	12,0
Fd	–	16,0
VH	–	27,0

Таблиця 6.5.

Характеристика методів визначення білка

Метод	Необхідна кількість білка, мг	Деструкція білка	Залежність від амінокис лотного складу	Особливості
1	2	3	4	5
Біуретова реакція	0,50–5,00	Відбувається	Низька	Лужний реактив; NН4-іони заважають визначенню. Швидкий розвиток забарвлення
Продовження таблиці
1	2	3	4	5
Метод Лоурі	0,01–0,05	Відбувається	Помірна	Повільний розвиток забавляння
Поглинання	0,05—0,10	Не відбувається	Значна	Поглинаючі в УФ- світлі речовини заважають визначенню. Забарвлення отримують миттєво
Зв’язування барвника	0,01—0,05	Відбувається	Помірна	Кисли реактив; Фарбування кювет. Швидкий розвиток забарвлення

Біуретовая реакція. Метод заснований на здатності лужного розчину солі міді утворювати мідь-білковий комплекс пурпурного кольору з пептидними ланцюгами білків (але не з бічними групами амінокислотних залишків). Інтенсивність цього забарвлення прямо пропорційна концентрації білка в розчині і її можна визначити спектрофотометрично при 540 або 310 нм. Метод вирізняється високою відтворюваністю, проте його чутливість низька. Крім того, для отримання тонких даних необхідні декілька міліграм зразка. Метод непридатний для визначення білка у фракціях, висолених сульфатом амонію(таблиця 6.5.).

Метод Лоурі. В основі визначення концентрації білка методом Лоурі лежить реакція відновлення реактиву Лоурі – Фоліна – Гіокалто (реактив Фоліна) комплексом, що утворюється при взаємодії білка з іонами міді в лужному розчині (біуретова реакція). В результаті реакції виникає темно-синє забарвлення, інтенсивність якого пропорційна концентрації білка в розчині, причому будь-який пептидний зв'язок білка змінює забарвлення зразка, хоча і різною мірою. При аналізі проб з концентрацією білка 5 – 25 мкг/мл спектр поглинання фарбника, що утворився по закінченню реакції, має максимум при 750 нм, а при аналізі проб з більшою масовою часткою білка – при 500 нм. Величина оптичної щільності при проміжних значеннях довжини хвилі (600 нм) складає приблизно 90 % величини, отриманої при 750 нм. Тому інтенсивність забарвлення можна вимірювати при відповідній довжині хвилі в діапазоні 600 – 750 нм. Метод Лоурі вирізняється високою точністю й чутливістю (таблиця 6.5.), широко використовується в повсякденній практиці.

Поглинання в УФ області спектру. Визначення кількості білка в УФ- променях базується на поглинанні світла амінокислотами, які присутні в білках Максимум поглинання триптофану в УФ- області спектр – при 257 нм, а тирозина – при 294 нм. Виміри звичайно проводять при 280 нм. Не дивлячись на те, що метод не має високої чутливості й точності, його успішно застосовують для швидкого визначення білка в хроматографічних елюатах, побудови профілів елююваного зразка з колонки. Метод придатний для визначення кількості білка в розчині за калібрувальною кривою, проте внаслідок неоднакового вмісту триптофану і тирозину в різних білках отримані результати можуть виявитися невірогідними (виключення складають визначення, в яких для побудови калібрувальної кривої взяті аналогічні зразки чистих білків).

Перевагою метода є можливість використовувати в наступних аналізах зразки, в яких визначали білок.

Метод зв’язування барвників. Суть методу полягає в тому, що деякі барвник при зв’язуванні з білком дають специфічне забарвлення, інтенсивність якого залежить від концентрації білка і може бути визначена спектрофотометрично або іншими способами. Найчастіше використовують барвник кумассі С-250, який у надхлорній кислоті забарвлює розчин в червоно–брунатний колір, а при зв’язуванні з білком за тих же умов – в синій. Інтенсивність забарвлення визначають при 595 нм. Цей метод більш чутливіштй та простіший й не менше точний, ніж метод Лоурі (таблиця 6.5. ). До його недоліків можна віднести тільки те, що адсорбований на стінках кювети барвник потрібно відмивати перед кожним вимірюванням розчином додецилсульфату натрію (ПДВ).

Завдання 6. Побудувати калібрувальну криву для визначення кількості білка за поглинанням в УФ –світлі при 280 нм

Прилади. Спектрофотометр; аналітичні ваги, гомогенізатор.

Обладнання. Мірні хімічні стакани на, 100, 10 мл, скляні палички оплавлені з одного кінця, піпетки; градуйовані на 5-10 мл; мірні пробірки, штатив для пробірок, фарфорова ступка з товкачиком.

Реактиви. Бичачий сироватковий альбумін чи будь-який очищений білок; 0,15моль / л розчин хлориду натрію.

Дослідні матеріали: м’ясо, сир, клубні картоплі, тощо.

Хід виконання роботи