8)Діагностика та ідентифікація вірусів.

Метод рослин-індикаторів та електронна мікроскопія. Їх різновидності. Імунологічні властивості вірусів. Поняття реакції антиген-антитіло на прикладі вірусних патогенів. Серологічні методи в фітовірусології. Пріоритет та недоліки. Модельна система отримання антитіл до фітовірусів. Моно- та поліклональні антитіла. Полімеразна ланцюгова реакція.

Метод рослин – індикаторів передбачає використання чутливих рослин до механічної інокуляції в них вірусу. Як правило, легше механічно заразити вірусом трав’янисту рослину, ніж деревну культуру, дводольну ніж однодольну, молоді проростки, ніж старі. Робота із вірусом, як із модельною системою, передбачає постійне підтримання його в активному стані. Для цього досліднику необхідно підбирати такі рослини, які після штучного зараження досить довго зберігають в собі вірус, проявляють на собі зовнішні симптоми вірусного ураження, накопичують його у великих кількостях та концентраціях та рослини, які придатні до оцінки інфекційності вірусу, яку проводять шляхом підрахунку первинних пошкоджень (локальних пошкоджень в інокульованих листках). Для цієї мети підбирають різні види рослин. Наприклад, вірус мозаїки люцерни можливо зберігати довгий час на люцерні, але надзвичайне його розмноження можна отримати на рослинах тютюну, а для діагностичної оцінки інфекційності краще використовувати листки квасолі звичайної, а характерні симптоми, що відрізняють його від інших вірусів, з’являються на 37 тютюну, квасолі та лободі Chenopodium amaranticolor. Тим самим, використовуючи метод рослин-індикаторів та фіксуючі зовнішні специфічні симптоми ураження, можна діагностувати різний рослинний матеріал на ураження вірусами. Наступним ефективним діагностичним методом в вірусології являється метод електронної мікроскопії. Електронний мікроскоп являється найбільш використовуємим приладом для вірусологів, і нажаль самим коштовним. Те, що віруси можливо побачити тільки за допомогою пучка електронів було визначено ще у 1873 році Ернстом Аббе, який відмітив про те, що розрішаюча спроможність світлового мікроскопу залежить від апертури лінз його об’єктиву та довжини хвилі світла. По скільки навіть при максимальній апертурі розрішаюча спроможність не перевищувала навіть половини довжини хвилі світлової хвилі, то за допомогою світлового мікроскопу можливо було побачити тільки віруси із родини Poxviridae, наприклад вірус осповакцини (його розміри 300х200 нм). Використовуючи видимий пучок електронів замість видимих променів, теоретично можливо отримати більше розрішення. І це дійсно так. Електронні мікроскопи досягають значень 0,2 – 0,4 нм розрішаючою спроможності, чого являється достатньо для вивчення структури та будови багатьох біологічних макромолекул. Отриманий тим чи іншим шляхом пучок електронів в електронному мікроскопі прискорюється за допомогою високої напруги і тоді фіксується системою електростатичних чи електромагнітних луп. В системі мікроскопу підтримується високий вакуум, і тому такі летючі речовини як вода випаровуються. Саме тому необхідно спеціально виготовляти електронно- мікроскопічні препарати із певною концентрацією в них об’єктів (наприклад для вірусів 1 млрд часток на 1 мл). Зразок спостерігається під електронним мікроскопом тому, що він розсіює або приломлює чи змінює фазу прохідного через нього електронного променю, який тоді реєструється за допомогою флуоресцентного екрану, фотоемульсії або детектору електронів. Відомо багато різновидновидностей електронної мікроскопії, як одного із ефективних методів діагностики рослинного матеріалу на вірусоносійство. Але наряду із прислівом: “ Краще один раз побачити, ніж почути”, не слід забувати про те, що іноді можливо і не побачити вірус в пробі, коли він там буде знаходитись. Справа в концентрації препарату. Іноді метод електронної мікроскопії не може являтись направляючим у варіанті експрес-діагностики. Але все ж таки, коли вірус спостерігається в полі зору, питання про його присутність в матеріалі автоматично знімається. В іншому випадку, коли дослідник має справу із невеликими концентраціями патогенів в досліджуємому матеріалі, своє вагоме слово мають імунологічні методи досліджень. Імунологія – це наука про імунітет. Вона вивчає механізми та шляхи управління імунітетом, а також розробляє імунологічні методи діагностики, 38 лікування та профілактики захворювань. Основоположниками імунології прийнято рахувати англійського лікаря Дженнера (1749 – 1823) та Луі Пастера , який в 1881 році зробив повідомлення про те, що у випадку зараження курей ослабленим збудником холери курей, вони стають стійкими у варіанті зараження високовірулентними культурами. Звідси і пішло вчення вакцинації (вакка – корова), названої Пастером на честь Дженнера, який працював із коров’ячою віспою багато років тому. Трохи пізніше, імунологія набуває широкого розвитку. Із таким пов’язано відкриття І.І. Мечниковим в 1883 році теорії фагоцитозу та вчення про клітинний імунітет та теорії гуморального імунітету, сформульованої Ерліхом. В 1908 році їм була присуджена Нобелівська премія, як фундаторам сучасної імунології. Імунологія складається із двох великих взаємопов’язаних розділів. Перший – вчення про імунну систему організму, тобто про таку реагуючу систему, що дозволяє розпізнати генетично чужорідних речовин. Як раз вона забезпечує імунітет – захист від вірусів, бактерій, паразитів, елімінацію (виведення) відмираючих та мутаціонно змінившися власних клітин тіла. Другий розділ імунології – вчення про антигени, тобто о структурі та властивостях біологічних субстанцій, які являються чужерідними для організму, і призводять до виробки на них клітин – антитіл, що їх нейтралізують. Головне питання, що виникає у випадку вірусного процесу, це як проходить інфікування та послідуюча інактивація вірусу в організмі, вірус як антиген, і як виробляються проти нього антитіла? Імунітет при вірусних інфекціях, як відомо, забезпечується антитілами та сенсибілізованими Т-лімфоцитами. До речі, у випадку вірусів, що циркулюють в крові, то останні можуть бути знешкоджені та виведені із організму механізмами гуморального імунітету. Антитіла інактивують вірус блокуючи перші етапи взаємодії із клітиною – адсорбція та проникнення. Вони ж інактивують також токсичні властивості вірусу. Стабільність комплексу вірус – антитіло залежить від різновидностей чутливості вірусу до антитіла – їхньої авидності, температури та часу контакту тощо. Нерідко сполучення вірусу із антитілом має зворотній характер, тобто вірус спроможен зберігати свої біологічні властивості після роз’єднання із антитілом. Важливо знати, що антитіла не спроможні спричинити вплив на вірус, що знаходиться в нутрі зараженої клітини. В цьому випадку в організмі синтезуються цитотоксичні Т-лімфоцити, які спроможні лізувати тільки вражені вірусом клітини. Звідси, із-за внутрішньоклітинного розмноження вірусів, вагома частка належить клітинному імунітету. Крім сенсибілізованих Т-лімфоцитів при проникненні вірусів в клітини включаються К-кіллери та природні кіллери, особливо при вірусних інфекціях типу грипп та парагрипп, що мають короткий інкубаційний період. Слід також зауважити, що деякі віруси не дивлячись на імунну відповідь постійно персистують в організмі хазяїну (наприклад вірус 39 герпесу). Вони інтегруються в геном клітини без прояву клінічних симптомів. Надзвичайно цікавий факт про те, що віруси рослин попадаючи в організм тваринного походження також викликають процес синтезу антитіл. Направляюча теорія по активації цього процесу досить не погано описана. Вірусний антиген являється чужорідним по відношенню до головного комплексу гістосумісності, навіть коли він уражає в умовах in vivo рослину. Зразу ж після його попадання в організм проходить вироблення імуноглобулінів, яких відомо п’ять видів – M,G,A,D та Е, і які відрізняються по віку життя в організмі. Перші із них самі короткоживучі – від декількох годин до декількох днів, інші спроможні жити роками в організмі, виступаючи в ролі постійного і стабільного імунітету. Вся теорія виробки антитіл полягає в синтезі специфічних клітин, що своїми реакційними центрами (епітопами) блокують антигенні детермінанти по принципу зв’язування фермент – субстрат, ключ до замку. Тобто синтез антитіл відбувається згідно зовнішньої будови вірусів, його морфологічних ознак. Навіть невеликі зміни в будові вірусних капсидів потребують синтезу специфічних антитіл, які будуть визначатись вірусспецифічністю і будуть встановлювати штамоспецифічність навіть у одного і того ж роду вірусу, що визнано називати ізолятами даного вірусу. Введення вірусу в організм викликає синтез імуноглобулінів типу М, повторне введення посилює імунну відповідь організму і спричиняє виробку імуноглобулінів інших типів, які більш стійкіші . Постає питання, що ж таке реакції імунітету? РІ – це реакції між антигеном та антитілом або між антигеном та сенсибілізованими лімфоцитами, які проходять в живому організмі та спроможні до проведення в умовах in vitro. Реакції між АГ та АТ називають серологічними (від грецької – серум – сироватка) або гуморальними (від латинської – гумор – рідина). Реакції АГ із сенсибілізованими лімфоцитами називають клітинними. В вірусології та фітовірусології зокрема розрізняють багато видів та модифікацій серологічних реакцій, які направлені на діагностику, ідентифікацію та виявлення навіть у супермалих концентраціях вірусів в патологічному матеріалі. Для фітовірусології відомо досить велику низку серологічних методів. Так, в 1977 році два вчених Кларк та Адамс запропонували світу використання імуноферментного аналізу (ІФА) для детекції фітовірусів. Цей метод дуже чутливий і спроможен зафіксувати вірусний антиген навіть якщо його концентрація складає 0,3 г/кг патологічного матеріалу (наприклад листків, що уражені вірусом). Розглянемо основні і широко використовуємі серологічні методи в вірусології. Слід також зауважити про існування моноклональних антитіл – АТ, які можливо отримати з'єднанням клітини міеломи із В-лімфоцитами із 40 селезінки миші, імунізованої специфічним антигеном. В результаті отримують гібридні клітини (гібридоми), які певний час продукують високоспецифічні антитіла одного типу (МКА). Їх можливо використовувати із лікувально-профілактичною метою при деяких інфекційних захворюваннях. На прикінці лекції, необхідно зауважити про пріоритети та недоліки використання серологічних реакцій. До пріоритетів слід віднести високу чутливість та специфічність методів при детекції вірусних антигенів, швидкість визначення присутності антигену в пробі та його ідентифікації. До недоліків можна віднести високу коштовність у варіанті отримання МКА, та реактивів для проведення серологічних методів. Також існує ціла низка артефактів при проведенні ІФА, коли є варіант зв’язування АТ2 із присутньою в рослині в нормі пероксидази. Слід робити висновок про присутність того чи іншого вірусу в пробі спираючись на різні варіанти серологічних реакцій, а також на результати по зараженню рослин-індикаторів, електронної мікроскопії тощо.