8.1 Полімеразно-ланцюгова реакція .

Принцип методу полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР) був розроблений Кері Мюллисом в 1983 році. Відкриття ПЛР стало однією з найбільш видатних подій в області молекулярної біології за останні 20 років. За розробку ПЛР-аналізу К. Мюллис в 1993 році був удостоєний Нобелівської премії в області хімії. Поява методу ПЛР була обумовлена певними досягненнями в області молекулярної генетики, передусім розшифровкою нуклеотидної послідовності геномів ряду мікроорганізмів. Не можна також не сказати, що ПЛР стала можливою завдяки відкриттю унікального ферменту taq -ДНК-полимеразы, що міститься у бактерій, що мешкають в гейзерах. Особливість цього ферменту полягає в його винятковій термостійкості (період напівжиття при 95О і складає 40 хвилин) і високій робочій температурі - оптимум роботи 72ОС. Витонченість, простота виконання, неперевершені показники чутливості і специфічності принесли новому методу небувалу популярність. За короткий час ПЛР-аналіз поширився по всьому світу. Діагностика інфекційних захворювань, у тому числі викликаних важко культивованими агентами, генотипування мікроорганізмів, оцінка їх вірулентності, визначення стійкості мікрофлори до антибіотиків, пренатальна діагностика біологічний контроль препаратів крові - ось неповний перелік напрямів медицини, де з успіхом застосовується ПЛР.

8.2Принцип методу полімеразної ланцюгової реакції.

Полімеразна ланцюгова реакція (ПЛР) - метод ампліфікації ДНК in vitro, за допомогою якого протягом декількох годин можна виділити і розмножити певну послідовність ДНК в мільярди разів. Можливість 41 отримання величезної кількості копій однієї строго певної ділянки генома значно спрощує дослідження наявного зразка ДНК. У основі методу ПЛР лежить природний процес - добудовування комплементу ДНК матриці, здійснюване за допомогою ферменту ДНК- полімерази. Ця реакція носить назву реплікації ДНК.

Природна реплікація ДНК включає декілька стадій:

1) Денатурація ДНК (розплітання подвійної спіралі, розбіжність ниток ДНК);

2) Утворення коротких дволанцюгових ділянок ДНК (затравок, необхідних для ініціації синтезу ДНК);

3) Синтез нового ланцюга ДНК (добудовування комплементу обох ниток) Відкриття термостабільної ДНК-полимеразы (Taq -полимеразы) з термофільних бактерій Thermis aquaticus, оптимум роботи якої знаходиться в області 70-72 градусів, дозволило зробити процес реплікації ДНК циклічним і використовувати його для роботи in vitro. Створення програмованих термостатів (амплификаторов), які за заданою програмою здійснюють циклічну зміну температур, створило передумови для широкого впровадження методу ПЛР в практику лабораторної клінічної діагностики. При багатократному повторенні циклів синтезу відбувається експоненціальне збільшення числа копій специфічного фрагмента ДНК, що дозволяє з невеликої кількості аналізованого матеріалу, який може містити одиничні клітини мікроорганізмів отримати достатню кількість ДНК копій для ідентифікації їх методом електрофорезу. Добудовування комплементу ланцюга починається не в будь-якій точці послідовності ДНК, а тільки в певних стартових блоках - коротких двониткових ділянках. При приєднанні таких блоків до специфічних ділянок ДНК можна спрямувати процес синтезу нового ланцюга тільки в цій ділянці, а не по усій довжині ДНК ланцюга. Для створення стартових блоків в заданих ділянках ДНК використовують дві олигонуклеотидные приманки (20 нуклеотидных пара), звані праймерами. Праймери комплементарны послідовностям ДНК на лівій і правій межах специфічного фрагмента і орієнтовані таким чином, що добудовування нового ланцюга ДНК протікає тільки між ними. Для отримання достатньої кількості копій шуканого характеристичного фрагмента ДНК ампліфікація включає декілька (20-40) циклів. Таким чином, ПЛР є багатократним збільшенням числа копій (ампліфікація) специфічної ділянки ДНК що каталізує ферментом ДНК- полимеразой. Для проведення ампліфікації потрібні наступні компоненти:

1 етап: Денатурація ДНК (розплітання подвійної спіралі). Протікає при 93-95 градусах протягом 30-40 сек.

2 етап: Приєднання праймерів (відпал). Приєднання праймерів відбувається комплемент арно до відповідних послідовностей на протилежних ланцюгах ДНК на межах специфічної ділянки. Для кожної пари праймерів існує своя температура відпалу, значення якої розташовуються в інтервалі 50-65 градусів. Час відпалу - 20-60 сек.

3 етап: Добудовування ланцюгів ДНК. Добудовування комплементу ланцюгів ДНК походить від 5-конца до 3 -концу ланцюга в протилежних напрямах, починаючи з ділянок приєднання праймерів. Матеріалом для синтезу нових ланцюгів ДНК служать ті, що додаються в розчин дезоксирибонуклеотидтрифосфати (дНТФ). Процес синтезу каталізує ферментом термостабільною ДНК-полімеразою (Taq-полимеразою) і проходить при температурі 70-72 градусів. Час протікання синтезу - 20-40 сек.