5.4. Учет анализов, оформление направлений

и выдача результатов

Ответ о положительном результате может быть предварительным и окончательным.

Предварительный положительный ответ выдают по результатам ускоренного исследования нативного материала и после подращивания его в пептонной воде с помощью иммунофлюоресцентного метода, специфической иммобилизации, РНГА, а также по слайд-агглютинации сыворотками О1 и О139 подозрительных на холерный вибрион колоний. При наличии возможности на этом этапе может быть использована ПЦР со специфическими праймерами.

Предварительный ответ в случаях проведения срочных анализов сообщают устно и только при совпадении результатов не менее двух методов.

В условиях эпидемии холеры при проведении массовых исследований после идентификации первых культур такой ответ дает право на проведение противоэпидемических мероприятий.

Окончательный положительный ответ выдают по результатам сокращенной или полной идентификации выделенной культуры в течение 36 - 48 ч.

При проведении массовых исследований в очаге заболеваний холерой, когда первые культуры холерных вибрионов уже были идентифицированы по полной схеме, положительные результаты тестирования в слайд-агглютинации с холерными сыворотками О1 или О139 серогрупп в сочетании с морфологией и подвижностью клеток культур, выделенных от больных диареями или при обследовании на вибриононосительство, следует считать окончательными для решения вопросов о проведении противоэпидемических мероприятий. Достоверность таких результатов повышается при использовании ускоренных методов диагностики: иммунофлюоресцентного, иммобилизации соответствующими сыворотками, ПЦР и др.

Для полной идентификации выделенные культуры передают в назначенную для этих целей группу или лабораторию, специалисты которой при необходимости вносят в ответ соответствующие коррективы и дополнения, касающиеся определения антибиотикограммы, эпидемической значимости и токсигенности.

Отрицательный ответ может быть дан только по окончании исследования по полной схеме через 36 - 48 ч; при осуществлении эпиднадзора в условиях односменной работы лаборатории, допускающей использование теллурита калия, продолжительность анализа увеличивается до 3 - 4 суток.

Не допускается выдавать отрицательные ответы по результатам ускоренного исследования (МФА, РИВ, РНГА и др.) до окончания анализа как в условиях эпидемии холеры, так и при проведении эпидемиологического надзора.

Схему выдачи ответов см. на рис. 3.

┌──────────────┐

┌─────────┤ ОТВЕТ ├─────────┐

\/ └──────────────┘ \/

┌─────────────────┐ ┌───────────────────┐

│ ПОЛОЖИТЕЛЬНЫЙ │ │ ОТРИЦАТЕЛЬНЫЙ │

└─┬─────────────┬─┘ └─────────┬─────────┘

\/ \/ \/

┌──────────────────┐ ┌───────────────────┐ ┌───────────────────┐

│ ПРЕДВАРИТЕЛЬНЫЙ │ │ ОКОНЧАТЕЛЬНЫЙ │ │ ОКОНЧАТЕЛЬНЫЙ │

└──────────────────┘ └───────────────────┘ └───────────────────┘

Сообщается устно Сообщается письменно Сообщается письменно

и только в случаях по результатам по окончании

проведения срочных полной или сокращенной исследования по

анализов по идентификации полной схеме.

результатам выделенной культуры с Запрещается выдавать

ускоренного указанием отрицательный ответ

исследования антибиотикограммы и по результатам

нативного материала эпидзначимости. ускоренного

и после исследования.

подращивания в 1%

п.в. (РИВ, МФА,

РНГА и ПЦР), а

также слайд-

агглютинации

подозрительных

колоний с

сыворотками О1

и О139.

Рис. 3. Схема выдачи результатов исследований на холеру

При осуществлении эпидемиологического надзора направление к анализу, а соответственно и ответ на него, оформляют индивидуально на каждого больного. При проведении большого объема исследований в очаге холеры направления к анализам и ответы на них оформляют списком. При обследовании здоровых людей на вибриононосительство и исследовании на холеру объектов окружающей среды групповые формы направления и ответов допускаются как при эпиднадзоре, так и в очаге холеры.

Учет анализов и культур ведут по установленным формам (Прилож. 6, 7). Обязательным является ведение рабочих записей идентификации исследования подозрительных культур (Прилож. 8), регистрация выделенных культур (Прилож. 9), составление паспорта штамма (Прилож. 10).X

При работе в очаге холеры используют упрощенные формы регистрации анализов, учитывая, что более подробные сведения имеются в бланках направлений, находящихся в лаборатории до ликвидации очага. Для удобства работы направления за каждый день подшивают отдельно.

6. Методы изучения свойств холерных вибрионов

6.1. Серологические методы

Принадлежность холерных вибрионов к О1 или О139 серогруппе определяют в слайд-агглютинации или развернутой реакции агглютинации с холерными агглютинирующими сыворотками О1, Инаба, Огава, РО и с холерной сывороткой О139 серогруппы в соответствии с инструкциями по применению препаратов, а также в других реакциях с иммуноглобулиновыми препаратами, предназначенными для ускоренной диагностики холеры и идентификации возбудителя.

Слайд-агглютинацию ставят на обезжиренном стекле, помещенном в чашку Петри или на дне самой чашки, используя подозрительную на холерный вибрион колонию и (или) агаровую 12 - 18-часовую культуру и сыворотки О1 серогруппы в разведении 1:50 - 1:100. Сыворотку О139 разводят в соответствии с указанием на этикетке. Реакцию обязательно сопровождают контролями культуры в 0,9%-м растворе хлорида натрия.

Развернутую реакцию агглютинации ставят и учитывают по общепринятой методике в соответствии с инструкцией по применению диагностических сывороток.

Для исключения спонтанной агглютинации рекомендуется ставить развернутую реакцию в 0,3%-м растворе NaCl.

Диагностические сыворотки двукратно разводят 0,3%-м раствором

натрия хлорида в объеме 0,5 мл соответственно величине

диагностического титра. Суспензию изучаемой культуры готовят в

9 9

этом же растворе концентрацией 3 х 10 - 5 х 10 м.к./мл в объеме

8 - 10 мл. Взвесь выдерживают при комнатной температуре в течение

1,0 - 1,5 ч. В реакции используют поверхностный слой микробной

взвеси, разведенной 0,3%-м раствором натрия хлорида до

концентрации 1 млрд. м.к./мл, добавляя ее по 0,5 мл во все

разведения сыворотки и контроль культуры (0,5 мл 0,3%-го раствора

натрия хлорида + 0,5 мл взвеси культуры). Учет и оценка

результатов аналогичны основному варианту развернутой реакции.

Флюоресцентно-серологический метод

(МФА - метод флюоресцирующих антител)

Метод дает возможность ускоренно идентифицировать выделенную

культуру, а также выявить возбудителя холеры О1 и О139 серогруппы

5

при содержании его в исследуемом материале не менее чем 10

м.к./мл. Исследованию подлежат выделенная культура, нативный

материал (испражнения и рвотные массы) и материал после

подращивания.

Порядок приготовления мазков, обработка их флюоресцирующими иммуноглобулинами, микроскопия и оценка результатов, являющиеся общими для всех бактерий, описаны в "Наставлениях по применению иммуноглобулинов диагностических флюоресцирующих холерных адсорбированных лошадиных сухих".

Положительный результат может быть получен через 1,5 - 2,0 ч от начала исследования.

При просмотре мазков, обработанных иммуноглобулином холерным флюоресцирующим, особое внимание следует обращать на морфологию светящихся микробов, т.к. в отдельных случаях в мазках из испражнений здоровых людей может наблюдаться свечение микроорганизмов, отличающихся по морфологии от вибрионов (грубые крупные палочки, кокки).

Для устранения неспецифического свечения целесообразно использовать в качестве "гасителя" бычий альбумин, меченый родамином. Методика его использования описана в "Инструкции по применению альбумина бычьего, меченого родамином, сухого".

Реакция иммобилизации вибрионов под влиянием

специфических холерных сывороток О1 и О139 серогрупп (РИВ)

Метод дает возможность обнаружить возбудителя в течение

нескольких минут при концентрации его в исследуемом материале не

5

менее 10 м.к./мл. На предметное стекло пипеткой или петлей

наносят 2 капли испражнений, рвотных масс или поверхностного слоя

среды обогащения. Первую каплю накрывают покровным стеклом

(контроль), ко второй добавляют каплю О1 сыворотки в разведении

1:50, перемешивают и также накрывают покровным стеклом.

Раздавленную каплю смотрят под микроскопом при увеличении

х400 - 600, используя фазово-контрастное устройство или конденсор

темного поля.

При наличии в исследуемом образце холерных вибрионов в первой капле наблюдают характерную подвижность, во второй - иммобилизацию отдельных микробных клеток и образование неподвижных микроагглютинатов немедленно или в течение 1 - 2 мин. В случае неспецифического взаимодействия с диагностическими сыворотками наблюдается образование мелких подвижных конгломератов при активной подвижности отдельных клеток.

Реакция иммобилизации специфична и позволяет дать первый сигнальный ответ через 15 - 20 мин. от начала исследования нативного материала. При отрицательном результате исследование повторяют после подращивания в 1%-й пептонной воде.

В случае отрицательного результата необходимо провести аналогичное исследование с холерной сывороткой О139 серогруппы, которую разводят 1:5.

Реакция непрямой гемагглютинации (РНГА)

с использованием диагностикума эритроцитарного

холерного иммуноглобулинового

Порядок подготовки материала, ингредиентов, постановки реакции и ее учет изложены в "Инструкции по применению диагностикума эритроцитарного холерного антительного иммуноглобулинового", прилагаемой к препарату.