6.6.2. Определение эпидзначимости холерных вибрионов эльтор

комплексным методом - по отношению к диагностическим холерным

+ -

бактериофагам эльтор ctx и ctx в соответствии с наставлением к

препаратам и гемолитической активности

Методика определения гемолитической активности описана выше.

Для постановки пробы с фагом используют метод агаровых слоев.

Испытуемую культуру в объеме 0,5 мл добавляют пипеткой в пробирку

с 5,0 мл 0,5 - 0,7%-го агара Мартена рН 7,6 +/- 0,2,

расплавленного и охлажденного до 45 °С. После перемешивания все

содержимое выливают на подсушенную поверхность агара Мартена рН

7,6 +/- 0,2 в чашку Петри. После застывания слоя агара с культурой

+ -

на его поверхность наносят цельные фаги эльтор ctx и ctx . После

высыхания капель фагов чашки переворачивают агаром вверх и

инкубируют при температуре (37,0 +/- 0,5) °С.

По лизису фагами и гемолитической активности в пробе Грейга (табл. 6) исследуемые штаммы относят к эпидемически опасным (I группа, вариант 1), эпидемически неопасным (III группа, варианты 6, 7, 8) или требующим дополнительных исследований для заключения об их эпидзначимости (группа II, варианты 2, 3, 4, 5).

Таблица 6

СХЕМА ОЦЕНКИ ЭПИДЕМИЧЕСКОЙ ЗНАЧИМОСТИ

V. Cholerae eltor по чувствительности к бактериофагам

+ -

ctx И ctx И ГЕМОЛИТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ

┌──────┬────────┬─────────┬─────────┬────────────────────────────┐

│Группы│Варианты│ Гемолиз │Чувстви- │ Оценка эпидемической │

│ │ │по Грейгу│тельность│ значимости │

│ │ │ │к фагам │ │

│ │ │ ├────┬────┤ │

│ │ │ │ +│ -│ │

│ │ │ │ctx │ctx │ │

├──────┼────────┼─────────┼────┼────┼────────────────────────────┤

│I │1 │- │+ │- │Эпидемически опасны │

├──────┼────────┼─────────┼────┼────┼────────────────────────────┤

│II │2 │- │- │- │Для оценки эпидемической │

│ ├────────┼─────────┼────┼────┤значимости необходимы допол-│

│ │3 │- │+ │+ │нительные исследования на │

│ ├────────┼─────────┼────┼────┤наличие генов ctx АВ, tcp А │

│ │4 │+ │+ │+ │или определение токсиген- │

│ ├────────┼─────────┼────┼────┤ности на кроликах-сосунках │

│ │5 │+ │+ │- │ │

├──────┼────────┼─────────┼────┼────┼────────────────────────────┤

│III │6 │+ │- │+ │Эпидемически не опасны │

│ ├────────┼─────────┼────┼────┤ │

│ │7 │+ │- │- │ │

│ ├────────┼─────────┼────┼────┤ │

│ │8 │- │- │+ │ │

└──────┴────────┴─────────┴────┴────┴────────────────────────────┘

6.6.3. Определение токсигенности холерных вибрионов на модели кроликов-сосунков

Исследования проводят в лабораториях, имеющих разрешение на экспериментальную работу с микроорганизмами I - II групп патогенности.

Для заражения животных используют 4-часовую агаровую культуру,

выращенную при температуре (37,0 +/- 0,5) °С или 18-часовую - при

температуре (20,0 +/- 1,0) °С. Необходимо использовать две

5 7

заражающие дозы: 1 х 10 и 1 х 10 м.к., которые вводят

внутрикишечно в объеме по 0,2 мл двум кроликам. Заражающую дозу

контролируют путем высева на две чашки щелочного агара 0,1 мл

3

взвеси из разведения 1 х 10 м.к./мл. Кроликов 10 - 12-дневных

массой 130 - 160 г фиксируют к станку брюшком вверх, выстригают

шерсть на операционном поле и смазывают его йодом. Дают эфирный

или внутримышечно тиопенталовый наркоз (0,2 мл 1%-го раствора на

100 г массы). Делают разрез длиною 1 см по средней линии живота на

уровне пупка. Извлекают петлю тонкого кишечника на длинной

брыжейке, фиксируют с помощью мягкого пинцета и вводят взвесь

вибрионов. Петлю погружают в брюшную полость, брюшную стенку и

кожу послойно зашивают. Шов смазывают йодом. Оперированных

крольчат кормят с помощью шприца молоком и наблюдают 48 ч. Всех

погибших и умерщвленных через 48 ч животных вскрывают и делают

высев содержимого кишечника на чашки щелочного агара. Наиболее

выраженные изменения наблюдаются в толстом кишечнике, который

растянут бесцветной или светло-желтой прозрачной, или слегка

опалесцирующей жидкостью. Слепая кишка и прилегающие отделы

толстого кишечника могут быть настолько растянуты, что сквозь

них видны подлежащие петли кишечника, что создает видимость полной

прозрачности кишечного содержимого. Тонкий кишечник расширен и

также заполнен полупрозрачным содержимым. Описанные изменения

характерны для "синдрома холерогенности", наблюдаемого при

заражении эпидемически опасными, содержащими ген холерного токсина

штаммами.

Токсигенные (содержащие ген холерного токсина) штаммы холерных

вибрионов вызывают гибель большинства зараженных животных дозами 1

5 7

x 10 и 1 х 10 м.к. в течение первых двух суток с описанным выше

типичным "синдромом холерогенности".

Штаммы холерных вибрионов, не содержащие гена холерного токсина, как правило, не вызывают гибели животных и изменений в кишечнике или обусловливают накопление в кишечнике выживших или единичных павших животных мутной, бесцветной или коричневато-желтой жидкости, т.е. развитие энтеропатогенного синдрома, связанного с реализацией других факторов патогенности.

Обязательной проверке на модели кроликов-сосунков при отсутствии возможности определения эпидзначимости другими методами подлежат следующие штаммы V. cholerae О1 и О139 серогрупп.

а) Выделенные от людей:

- гемолизнегативные штаммы холерных вибрионов О139 серогруппы;

- гемолизпозитивные штаммы холерных вибрионов обеих серогрупп;

- гемолизнегативные штаммы холерных вибрионов О1 серогруппы,

атипичные по серологическим свойствам и устойчивые к фагам эльтор

+

и ctx .

б) Выделенные из объектов окружающей среды:

- гемолизотрицательные штаммы холерных вибрионов О1 и О139 серогрупп, выделенные при отсутствии эпидосложнений по холере.