8.3. Определение токсиннейтрализующих

антител в сыворотке крови

Для выявления токсиннейтрализующих антител в сыворотке крови больных холерой и вибриононосителей предназначена РНГА с эритроцитарным холерным энтеротоксическим диагностикумом (ЭХЭД), у которых инфицирование обусловлено холерными вибрионами О1 и О139 серогрупп. Токсиннейтрализующие антитела появляются на 5 - 7-й день болезни, достигая максимума на 14 - 21-й день, затем их титр постепенно снижается, но сохраняется дольше других антител. Иммуноглобулины к холерному токсину в сравнении с вибриоцидными и другими специфическими холерными антителами дольше циркулируют в сыворотке крови после перенесенной инфекции (до 8 - 10 и более месяцев). Условно положительным титром РНГА с ЭХЭД следует считать 1:160 и выше. Целесообразно исследовать парные сыворотки.

Результат РНГА с ЭХЭД позволяет сделать заключение о токсигенности (эпидемичности) циркулирующего в очаге штамма холерного вибриона, в том числе и без выделения культуры.

Приложение 1

(рекомендуемое)

НАПРАВЛЕНИЕ ПРОБ ОТ ЛЮДЕЙ

в лабораторию ________________________________________________

для исследования на __________________________________________

от "___" _____________ 200_ г.

N регист- рацион- ный <*>	N про- бы	Первич- ная или повтор- ная	Характер материа- ла	Ф.И.О.	Воз- раст	Диаг- ноз	Адрес места житель- ства	Место работы	Время отбора пробы	Приме- чание <**>
1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11

--------------------------------

<*> Регистрационный номер проставляют в лаборатории.

<**> Указать, принимал(а) ли антибиотики (если да - то какие, когда и сколько).

Пробы отбирали: ______________________________________________

__________________________________________________________________

__________________________________________________________________

(Фамиля, И.О., должность) (подписи)

Пробы доставил: ______________________________________________

(Фамиля, И.О., должность) (подпись)

Время доставки проб __________________________________________

(дата, время - часы, минуты)

Приложение 2

(рекомендуемое)

НАПРАВЛЕНИЕ ПРОБ ИЗ ОБЪЕКТОВ ОКРУЖАЮЩЕЙ СРЕДЫ

в лабораторию ________________________________________________

для исследования на __________________________________________

от "___" _____________ 200_ г.

N регис- трацион- ный <*>	N пробы	Место отбора проб	Объект для исследования	Характер материала	Объем (коли- чество)	Время отбо- ра пробы (ч, мин.)
1	2	3	4	5	6	7

--------------------------------

<*> Регистрационный номер проставляют в лаборатории.

Пробы отбирали: ______________________________________________

__________________________________________________________________

__________________________________________________________________

(Фамиля, И.О., должность) (подписи)

Пробы доставил: ______________________________________________

(Фамиля, И.О., должность) (подпись)

Время доставки проб __________________________________________

(дата, время - часы, минуты)

Приложение 3

(обязательное)

УКЛАДКА ДЛЯ ОТБОРА МАТЕРИАЛА ОТ БОЛЬНОГО С ПОДОЗРЕНИЕМ

НА ХОЛЕРУ ДЛЯ БОЛЬНИЧНОГО УЧРЕЖДЕНИЯ НЕИНФЕКЦИОННОГО

ПРОФИЛЯ, СТАНЦИЙ СКОРОЙ И НЕОТЛОЖНОЙ ПОМОЩИ,

ПОЛИКЛИНИК, СКО, СКП, ПСКП

1. Банки широкогорлые с крышками или притертыми

пробками емкостью не менее 100 мл 2 шт.

2. Контейнеры 100 - 200 мл с завинчивающейся крышкой

стерильные полипропиленовые 2 шт.

3. Стеклянные трубки с резиновой грушей для переноса

жидкого исследуемого материала в контейнеры 2 шт.

4. Контейнеры для испражнений 30 мл с ложкой

полипропиленовые 2 шт.

5. Пробирки с ватными тампонами или алюминиевыми петлями

(стерильные) 2 шт.

6. Клеенка медицинская подкладная 1 м

7. Полиэтиленовые пакеты 5 шт.

8. Салфетки марлевые 5 шт.

9. Направление на анализ (бланк) 3 шт.

10. Лейкопластырь 1 уп.

11. Карандаш простой 1 шт.

12. Карандаш по стеклу 1 шт.

13. Бикс (металлический контейнер) 1 шт.

14. Инструкция по забору материала 1 шт.

15. Хлорамин в пакетах по 30 г, рассчитанный на

приготовление 1 литра 3%-го раствора 1 шт.

16 Хлорная известь сухая в пакете из расчета 200 г на

1 кг выделений 1 шт.

17. Перчатки резиновые 2 пары

18. Емкость эмалированная 10 л 1 шт.

19. Пептонная вода 1%-я во флаконах по 50 мл, закрытых

резиновыми пробками и завальцованных металлическими

колпачками 4 шт.

20. Флаконы с 50 мл 0,9%-го раствора хлорида натрия

закрытые резиновыми пробками и завальцованные

металлическими колпачками 2 шт.

Приложение 4

(обязательное)

УКЛАДКА ДЛЯ ЗАБОРА ПРОБ ИЗ ОБЪЕКТОВ

ОКРУЖАЮЩЕЙ СРЕДЫ НА ХОЛЕРУ

1. Ящик тарный на 20 гнезд 1 шт.

2. Ящик металлический - укладка 1 шт.

3. Бутылки 0,5 л с ватно-марлевыми (и резиновыми)

пробками, с пергаментными бумажными колпачками 20 шт.

4. Флаконы с 50 мл 0,9%-го раствора натрия хлорида,

закрытые резиновыми пробками и завальцованные

металлическими колпачками 2 шт.

5. Спирт 96° 100 мл

6. Вата 100 г

7. Карандаш по стеклу 2 шт.

8. Карандаш простой 1 шт.

9. Бумага писчая 10 листов

10. Направление на анализ (бланк) 10 шт.

11. Бумага копировальная 5 листов

12. Пинцет 1 шт.

13. Банка 0,5 л с матерчатыми салфетками (15 шт.)

для отбора проб сточных вод 1 шт.

14. Термометр до 50 °С 1 шт.

15. Бумага индикаторная для определения рН (1 - 12) 1 упак.

16. Банка с притертой крышкой с ватными тампонами 1 шт.

17. Пробирки с тампонами для взятия смывов 20 шт.

18. Штатив на 20 гнезд 1 шт.

19. Батометр 1 шт.

20. Шпагат - мотки по 5, 10 и 30 м 45 м

21. Хлорамин в пакетах по 30 г, рассчитанный на

приготовление 1 литра 3%-го раствора 2 шт.

22. Емкость на 1 л для приготовления 3%-го хлорамина 1 шт.

23. Пакеты полиэтиленовые 5 шт.

24. Халат медицинский и шапочка 2 шт.

25. Перчатки резиновые 2 пары

26. Фартук и нарукавники клеенчатые 1 шт.

Приложение 5

(рекомендуемое)

СПОСОБ ОТБОРА КОЛОНИЙ ВИБРИОНОВ С ПОМОЩЬЮ

СТЕРЕОСКОПИЧЕСКОГО МИКРОСКОПА В КОСО ПРОХОДЯЩЕМ СВЕТЕ

Принцип метода заключается в том, что при просмотре колоний различных микробов под малым увеличением микроскопа или лупы при освещении их пучком света, косо падающим на поверхность агара, колонии приобретают способность светиться и кажутся окрашенными.

К стереоскопическому микроскопу МБС-2 или МБС-1 приспосабливают устройство для получения узкого пучка света и зеркало от микроскопа на подвижном шарнире для освещения чашки снизу под углом 45 - 50°.

Чашки с посевами просматривают после 12 - 18 ч инкубации. При величине угла падения луча света к поверхности агара в 40 - 50° колонии вибрионов по своей окраске заметно отличаются от других микроорганизмов.

Цвет колоний, выросших на щелочном агаре, при косом освещении:

Микроорганизмы	Цвет колонии
Холерные вибрионы	Преобладает серо-голубой с оттенком зеленовато- серым, синевато-зеленым, реже - зеленый с верх- ним краем красно-бурого или коричневого оттенка
Сальмонеллы	Розовый оттенок
Шигеллы	Розовый с фиолетовым оттенком
Кишечная палочка	Ярко-красный
Протей	Красный с фиолетовым оттенком

Приспособления для просмотра колоний в косо проходящем свете.

1. Столик стереоскопического микроскопа МБС-1 или МБС-2 заменяют специальным приспособлением для освещения чашки снизу под углом 45 - 50°. Источником света служит осветитель от микроскопа, на который надевают кожух с отверстием диаметром 5 мм против спирали лампочки для получения узкого пучка света. Узкий пучок света направляют в центр вогнутого зеркала, которое перемещается на подвижном шарнире поворотом винта в зависимости от необходимости угла падения света. Угол вычисляют по соотношению расстояния от зеркала до чашки, которое меняется произвольно, и расстояния от чашки до поверхности стола, остающегося неизменным.

Для удобства исследования осветитель и зеркало можно вмонтировать в ящик со стеклянной крышкой, на которую помещают чашку с посевом. Это дает возможность быстро находить нужный угол падения света, передвигая зеркало поворотом винта по вмонтированной шкале.

2. Приспособление, смонтированное из основных узлов стереоскопического микроскопа БМС-1 и прибора для счета колоний.

Из раструба верхней крышки прибора для подсчета колоний удалить оба стекла вместе с упорным кольцом и снять верхнюю крышку. Из скобы передней панели вывинтить вертикальную ось, после чего убрать диск со светофильтрами. Освободить два винта, прикрепляющие патрон лампочки освещения к кронштейну на задней панели. В крышку снизу вставить вертикальную штангу от узла лупы с таким расчетом, чтобы в рабочем положении прибора муфта с прижимным винтом оказалась на дне под кронштейном импульсного счетчика. В муфту зажать держатель с угловыми губками (из комплекта лабораторного штатива), предварительно укороченный до 110 мм. Держателем закрепить патрон с лампочкой в вертикальном положении. Крышку фиксировать винтами на своем обычном месте.

Штатив микроскопа МБС-1 вместе с бинокулярной насадкой отсоединить от столика и установить непосредственно на корпус прибора для счета колоний так, чтобы 3 сферических ножки основания штатива охватили раструб крышки прибора, а окно основания было обращено к наблюдателю. Подлежащие к просмотру чашки с посевами устанавливают над открытым окном. Нужную освещенность и угол падения света находят изменением положения лампы, которое достигается поворотом штанги, после чего последнюю фиксируют цанговым зажимом.

Приложение 6

(рекомендуемое)

ЖУРНАЛ

РЕГИСТРАЦИИ МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ МАТЕРИАЛА

ОТ БОЛЬНЫХ (ТРУПОВ) ЛЮДЕЙ С ПОДОЗРЕНИЕМ НА ХОЛЕРУ

И ДРУГИЕ КАРАНТИННЫЕ ИНФЕКЦИИ

N регист- рацион- ный	Фамилия, И.О.	В о з р а с т	П о л	Место работы, долж- ность	Место житель- ства (адрес)	Клини- ческий (пато- лого- анатоми- ческий) диагноз	Учреж- дение, направ- ляющее пробу	Цель иссле- дования	N, дата первич- ного анализа (год, месяц, число)	Приме- нение анти- биоти- ков	Дата и время		Иссле- дуемый мате- риал		Резуль- таты иссле- дования		Дата напра- вления ответа (месяц, число)		Подпись врача
											взятия пробы (год, месяц, число, час)	приема анализа (месяц, число, час)
1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11	12	13		14		15		16		17

Приложение 7

(рекомендуемое)

ЖУРНАЛ

РЕГИСТРАЦИИ МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ

ПРОБ ИЗ ОБЪЕКТОВ ОКРУЖАЮЩЕЙ СРЕДЫ

N регист- рационный	Объект исследо- вания	Адрес, место отбора проб	Количе- ство (объем) пробы	Наимено- вание учрежде- ния, напра- вившего пробы	Дата и время			Резуль- тат иссле- дования	Под- пись
					отбора пробы (год, месяц, число, час)	приема пробы (месяц, число, час)	выдачи ответа (месяц, число, час)
1	2	3	4	5	6	7	8	9	10

Приложение 8

(рекомендуемое)

ЖУРНАЛ

ИДЕНТИФИКАЦИИ КУЛЬТУР ХОЛЕРНЫХ ВИБРИОНОВ

N регист- рационный	N штам- ма	Вид мик- роба	Дата выделе- ния (число, месяц, год)	Объект иссле- дования	Морфо- логия клетки	Подвиж- ность	Морфо- логия колоний	Индофе- нолокси- даза	Лизинде- карбокси- лаза	Орнитин- декарбо- ксилаза	Арги- нинди- гидро- лаза	Расщепление глюкозы в среде Хью- Лейфсона		Ферментация
														саха- розы	араби- нозы	ман- нозы	ман- нита	ино- зита
												аэроб- ное	анаэ- робное
1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11	12	13	14	15	16	17	18	19

┌───────────────┬───────────────────┬────────────────────────────────┬────────────────────────────┬─────────┬────────┬────────┐

│ Ферментация │ Образование │ Взаимодействие с холерными │ Чувствительность к фагам │Реакция │Чувстви-│Гемоли- │

│ │ │ иммуноглобулинами в реакциях │ холерным │гемагглю-│тель- │тическая│

├───┬─────┬─────┼─────┬─────┬───────┼──────────────────────┬─────┬───┼──────┬────┬─────┬────┬─────┤тинации │ность к │актив- │

│ак-│крах-│жела-│индо-│серо-│ацетил-│ агглютинации │РНГА,│МФА│клас- │эль-│ + │ -│ТЭПВ │ │полими- │ность в │

│озы│мала │тины │ла │водо-│метил- ├──┬─────┬─────┬──┬────┤РТПГА│ │сичес-│тор │ctx │ctx │1 - 7│ │ксину │пробе │

│ │ │ │ │рода │карби- │О1│Огава│Инаба│РО│О139│ │ │кому │ │ │ │ │ │В 50 │Грейга │

│ │ │ │ │ │нола │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ед./мл │ │

├───┼─────┼─────┼─────┼─────┼───────┼──┼─────┼─────┼──┼────┼─────┼───┼──────┼────┼─────┼────┼─────┼─────────┼────────┼────────┤

│20 │ 21 │ 22 │ 23 │ 24 │ 25 │26│ 27 │ 28 │29│ 30 │ 31 │32 │ 33 │ 34 │ 35 │ 36 │ 37 │ 38 │ 39 │ 40 │

├───┼─────┼─────┼─────┼─────┼───────┼──┼─────┼─────┼──┼────┼─────┼───┼──────┼────┼─────┼────┼─────┼─────────┼────────┼────────┤

├───┼─────┼─────┼─────┼─────┼───────┼──┼─────┼─────┼──┼────┼─────┼───┼──────┼────┼─────┼────┼─────┼─────────┼────────┼────────┤

├───┼─────┼─────┼─────┼─────┼───────┼──┼─────┼─────┼──┼────┼─────┼───┼──────┼────┼─────┼────┼─────┼─────────┼────────┼────────┤

└───┴─────┴─────┴─────┴─────┴───────┴──┴─────┴─────┴──┴────┴─────┴───┴──────┴────┴─────┴────┴─────┴─────────┴────────┴────────┘

Токсиген- ность	ПЦР		ДНК- зонди- рование на ctx АВ		Чувствительность к антибиотикам															Заклю- чение <*>		Под- пись врача
					диско-диффузионный метод								метод серийных разведений
на кроли- ках-со- сунках	ctx АВ	tcp А			тетра- циклин	лево- мице- тин	док- сици- клин	ципроф- локсацин	нитро- фуран- тоин	ко-три- мокса- зол	другие (впи- сать)		тетра- циклин	левоми- цетин	док- сици- клин	ципроф- локсацин	нитро- фуран- тоин	ко-три- мокса- зол
41	42	43		44		45	46	47	48	49	50	51		52	53	54	55	56	57		58		59

--------------------------------

<*> Таксономическое определение, токсигенность с указанием метода определения, чувствительность к антибиотикам (значения МПК, мкг/м); при необходимости дифференциации от других видов патогенных вибрионов добавляют тесты: рост без NaCl, расщепление салицина, дульцита, целлобиозы, тест на бета-галактозидазу, наличие нитратредуктазы.

Приложение 9

(обязательное)

ЖУРНАЛ УЧЕТА ВЫДЕЛЕННЫХ ШТАММОВ МИКРООРГАНИЗМОВ

(ФОРМА N 513/У)

┌──┬──┐ ┌──┬──┐ ┌──┬──┐

Хранить 3 года начат │ │ │ │ │ │ │ │ │

└──┴──┘ └──┴──┘ └──┴──┘

┌──┬──┐ ┌──┬──┐ ┌──┬──┐ ┌──┬──┐ ┌──┬──┐ ┌──┬──┐

до │ │ │ │ │ │ │ │ │ окончен │ │ │ │ │ │ │ │ │

└──┴──┘ └──┴──┘ └──┴──┘ └──┴──┘ └──┴──┘ └──┴──┘

N п/п	N ана- лиза	Адрес и дата взятия пробы	Наиме- нование ПБА <*>	N штамма	Источник выделения	Дата выде- ления	Краткая характе- ристика ПБА <**>	Судьба ПБА <***>	Приме- чание
1	2	3	4	5	6	7	8	9	10

--------------------------------

<*> Патогенный биологический агент.

<**> Типичность; при атипичности указать отличительные признаки.

<***> Уничтожен (дата, N акта); передан в коллекцию, центр и т.д. (дата, N акта).

Приложение 10

(обязательное)

Паспорт штамма

Вид микроба __________________________ Штамм N ___________________

Ф.И.О. ______________________________ возраст ____________________

место жительства больного или вибриононосителя (подчеркнуть) _____

__________________________________________________________________

(республика, область, район, населенный пункт, улица, N дома

и квартиры)

Наименование объекта _____________________________________________

(река, озеро и т.п.)

наименование стационарной точки __________________________________

(зона сан. охраны, место

сброса сточных вод и т.п.)

сточные воды _____________________________________________________

(в очаге, коллектор, очистные сооружения

до или после очистки и т.п.)

другие объекты ___________________________________________________

(указать)

с указанием территории ___________________________________________

(республика, область, район, населенный пункт)

Дата забора материала ___________ Дата выделения культуры ________

Культуру выделил(а) ______________________________________________

(Ф.И.О. врача, учреждение)

Культуру подтвердил(а) ___________________________________________

(Ф.И.О. врача, учреждение)

Характеристика штамма

1. Морфология клеток _____________________________________________

Тинкториальные свойства __________________________________________

2. Подвижность ___________________________________________________

3. Культуральные свойства: на 1% п.в. ____________________________

на щелочном агаре ________________________________________________

4. Проба на оксидазу _____________________________________________

5. Лизиндекарбоксилаза ___________________________________________

орнитиндекарбоксилаза ___________ аргининдигидролаза _____________

6. Расщепление: глюкозы в среде Хью-Лейфсона (аэробн./

анаэробн.) _______, сахарозы ________, маннозы ________, арабинозы

________, маннита _________, инозита _________, лактозы _________,

крахмала _______

7. Протеолитическая активность ___________________________________

8. Агглютинабельность холерными сыворотками: (указать серии и титр

сывороток):

О1 ________________, Огава _______________, Инаба _______________,

РО _______________, О139 _________________________________________

9. Реакция с холерными О1 люминесцирующими антителами ____________

10. Чувствительность к холерным фагам: классическому ____________,

+ -

эльтор _______, ctx _______, ctx _______, ТЭПВ (1 - 7) _________

11. Гемолитическая активность по Грейгу __________________________

12. Реакция гемагглютинации ______________________________________

13. Чувствительность к полимиксину В 50 (ед./мл) _________________

14. Токсигенность:

комплексным методом (ctx фаги и гемолиз) _________________________

на кроликах-сосунках _____________________________________________

ПЦР ______________________________________________________________

ДНК-зондирование _________________________________________________

15. Антибиотикограмма

N п/п	Препарат	Значение		Результат
		МПК, мкг/мл	зона ингибиции роста, мм	чувстви- тельный	промежу- точный	устой- чивый
1	Доксициклин
2	Тетрациклин
3	Левомицетин
4	Ципрофлоксацин
5	Рифампицин
6	Нитрофурантоин
7	Ко-тримоксазол
8	Гентамицин
9	Ампициллин
10	Цефотаксим
	Другие (вписать)

16. Другие свойства ______________________________________________

17. Среда хранения _______________________________________________

Подпись врача ____________________________________________________

Примечание.

1) В графе 8 указывать: отр. или до титра; 1/2 титра и т.д.

2) В графе 10 указывать: до титра; 1/2 титра и т.д.