5.2. Порядок исследования

При бактериологическом исследовании на холеру используют различные питательные среды: жидкие среды обогащения, щелочной агар, элективные дифференциально-диагностические среды и набор сред для идентификации.

Применяют сухие среды производственного выпуска, имеющие номера госрегистрации и лицензии, или среды, консерванты, приготовленные по рецептуре и технологии, изложенной в разделе 7. Используемые для диагностики холеры питательные среды подлежат бактериологическому контролю в установленном порядке.X

Агаровые среды перед использованием должны быть тщательно подсушены. Посев делают так, чтобы получить рост в виде изолированных колоний. Все посевы инкубируют при температуре (37,0 +/- 0,5) °С.

Посевы исследуемого материала на всех этапах выращивают в 1%-й пептонной воде 6 - 8 ч, в пептонной воде с теллуритом калия - 12 - 18 ч, на щелочном агаре - не менее 14 - 16 ч, а на плотных элективных средах - 18 - 24 ч. Теллурит калия следует добавлять в 1%-ю пептонную воду с рН не ниже 8,3 +/- 0,1 до внесения исследуемого материала. Продолжительность хранения рабочего раствора теллурита калия (1:1000) - 7 дней, а питательных сред с теллуритом калия - не более 2-х суток при условии содержания их в холодильнике.

5.2.1. Исследование проб от больных и вибриононосителей секционного материала (рис. 1)

┌────────────────────────────────────────────────┐

│ Исследуемый материал │

└───┬───────┬─────────────────────────────────┬──┘

│ \/ \/

\/ ┌────┐──────────────────────────>┌──────────────────┐

┌──────┐ │ I │ ┌────┐ │Ускоренные методы:│

│ЩА, ЭС│ └─┬──┘──────────>│ II │─────────>│- МФА │

└───┬──┘ │ └─┬──┘ │- РИВ │

│ \/ \/ │- РНГА │

│ ┌──────┐ ┌────┐ │- ПЦР │

│ │ЩА, ЭС│ │ ЩА │ │ │

│ └──┬───┘ └─┬──┘ │ │

\/ \/ \/ │ │

┌──────────────────────────────────────────┐ │ │

│- отбор колоний │ │ │

│- высев подозрительных колоний на ЩА и ПУС│ │ │

└────────────────────────────────┬─────────┘ └──────────────────┘

\/

┌─────────────────────────┐

│Отбор культур по ПУС и ОП│

└────────────┬────────────┘

\/

┌──────────────┬────────────┬──────────┬─────────┬──────────┐

\/ \/ \/ \/ \/ \/

┌────┐ ┌─────┐ ┌────┐ ┌────┐ ┌────┐ ┌────┐

│ПУС+│ │ПУС+*│ │ОП+*│ │ПУС-│ │ПУС-│ │ПУС+│

│ОП+ │ │ │ │ │ │ОП+ │ │ОП- │ │ОП- │

└─┬──┘ └─────┘ └────┘ └─┬──┘ └─┬──┘ └─┬──┘

└──────────────────┬───────────────────┘ │ \/

\/ \/ ┌─────────┐

+ ┌─────────────────────────────────┐ - ┌─────────┐│Исследуют│

┌─┤ ОРА с сыворотками О1 и О139 ├───┐ │ Не ││ на │

│ └─────────────────────────────────┘ │ │исследуют││кишечную │

│ │ └─────────┘│ группу │

\/ \/ └─────────┘

┌─────────────────────────────────────┐┌─────────────────────────┐

│Сокращенная схема идентификации: ││Определение │

│- морфология и подвижность микробных ││принадлежности к роду │

│клеток ││Vibri, виду V. Cholerae │

│- ОП ││или другим видам │

│- O/F тест и отношение к отдельным ││патогенных вибрионов │

│углеводам и аминокислотам (табл. 4) │└─────────────────────────┘

│- МФА │

│- РИВ │

│- РА с сыворотками О1, Инаба, Огава, │

│РО или О139 │

│- чувствительность к фагам холерным │

│классическому и эльтор │

│Ориентировочная оценка эпидемической │

│значимости: │

│- гемолитическая активность по Грейгу│┌─────────────────────────┐

│- чувствительность к фагам холерным ││Условные обозначения: │

│ + - ││I и II - среда │

│эльтор ctx и ctx ││накопления; ЩА - щелочной│

├─────────────────────────────────────┤│агар; ЭС - элективная │

│Дополнительные признаки биовара ││среда для выделения │

│V. cholerae: ││холерных вибрионов; ПУС -│

│- гемагглютинация; ││полиуглеводная среда; │

│- чувствительность к полимиксину В ││ОП - оксидазная проба; │

│50 ЕД/мл ││ОРА - ориентировочная │

│- реакция Фогес-Проскауэра ││реакция агглютинации; │

├─────────────────────────────────────┤│РА - развернутая реакция │

│Определение антибиотикограммы ││агглютинации; МФА - метод│

│Окончательная оценка эпидемической ││флюоресцирующих антител; │

│значимости: ││РИВ - реакция │

│- ПЦР на наличие ctx АБ (А) и tcp А ││иммобилизации вибрионов; │

│генов ││РНГА - реакция непрямой │

│- токсигенность на кроликах-сосунках ││гемагглютинации; │

├─────────────────────────────────────┤│ПЦР - полимеразная цепная│

│Уточнение родовой и видовой ││реакция; │

│принадлежности атипичных культур по ││* - в случае отбора │

│расширенному набору признаков ││колоний только на ПУС или│

│(табл. 2, 3) ││ЩА │

└─────────────────────────────────────┘└─────────────────────────┘

Рис. 1. Схема лабораторного исследования на холеру

I этап

Испражнения, рвотные массы больных, а также содержимое кишечника, желчного пузыря и суспензию кусочков слизистой тонкого кишечника трупа в объеме 0,5 - 1,0 мл засевают пипеткой в 50 - 100 мл накопительной среды, петлей - на щелочной агар и одну из элективных сред (СЭДХ, TCBS).

При исследовании материала от больных с подозрением на заболевание холерой не допускается использование в качестве накопительной среды 1%-й пептонной воды с теллуритом калия.

В случае поступления материала от больных с подозрением на холеру могут быть использованы ускоренные методы исследования: иммуно-люминесцентный, иммобилизация и ПЦР со специфическими праймерами (см. раздел 6) на первом, втором и последующих этапах исследования.X

Материал от подозреваемых на вибриононосительство засевают в 50 мл среды накопления при индивидуальных анализах и в 100 мл - при групповых, объединяя в один флакон по 0,5 - 1,0 мл пробы не более чем от 5 человек. К групповым посевам прибегают в редких случаях при проведении массовых обследований на вибриононосительство.

Материал, доставленный в 5 мл 1%-й пептонной воды, полностью используют для посева в 50 мл среды накопления. В случае поступления в лабораторию материала, забранного в 50 мл 1%-й пептонной воды во флаконе, и доставки его не позже 2-х ч после забора пробы, флакон помещают в термостат на 6 ч для накопления возбудителя. При доставке материала в более поздние сроки 5 мл его засевают в 50 мл 1%-й пептонной воды.

В отдельных случаях при бактериологическом исследовании материала от лиц, принимавших антибиотики, активные по отношению к возбудителю холеры, его засевают в 200 - 300 мл 1%-й пептонной воды (предпочтительно в широкогорлые колбы) и на 2 чашки щелочного агара так, чтобы получить рост в виде изолированных колоний. Посевы инкубируют при 37 °С в течение 24 ч, производя последовательные высевы через 8 - 10 ч инкубации с поверхностного слоя среды на пластинки щелочного агара. Использование второй среды обогащения в этом варианте исследования нецелесообразно.

II этап (через 6 - 8 ч от начала исследования)

С первой среды накопления делают высев на щелочной агар и одну из элективных сред и в 5 - 8 мл второй среды накопления. Пересевы в жидкие и на плотные среды делают с поверхности жидкой среды большой бактериологической петлей диаметром 5 мм.

При отрицательных результатах исследования нативного материала ускоренными методами их повторяют после 6 ч инкубации первой среды накопления.

III этап (через 12 - 16 ч от начала исследования)

Высев со второй среды накопления на щелочной агар.

В случае необходимости ускорения хода анализа материала от больного, подозрительного на заболевание холерой, отбор колоний со щелочного агара, засеянного в начале исследования, можно начинать уже на этом этапе, в остальных случаях - на следующем.

IV этап (через 18 - 24 ч от начала исследования)

Отбор подозрительных на холерный вибрион колоний в посевах на плотные среды нативного материала, а также в высевах из 1-й и 2-й накопительных сред.

а) Чашки с посевами просматривают в проходящем свете невооруженным глазом или с помощью лупы, а также (особенно в вечернее и ночное время) под стереоскопическим микроскопом в косо проходящем свете и отбирают подозрительные на вибрионы колонии для выделения и идентификации культуры.

На щелочном агаре колонии холерных вибрионов О1 и О139 серогрупп в типичной S-форме - круглые, гладкие, плоские, голубоватые, гомогенные, с ровными краями, прозрачные в проходящем свете и светло-серые с голубым или зеленоватым оттенком под стереоскопическим микроскопом в косо проходящем свете (Прилож. 5).X

Колонии холерных вибрионов на элективных средах TCBS и СЭДХ имеют ярко-желтую окраску на зеленом или синем фоне среды, полупрозрачные. Размеры колоний на щелочном агаре через 10 - 12 ч инкубации обычно не превышают 1 мм, а к 18 - 24 ч достигают 2 - 3 мм в диаметре. Темпы формирования колоний холерных вибрионов на элективных средах несколько замедлены, поэтому просмотр посевов на СЭДХ или TCBS следует проводить не ранее чем через 18 - 20 ч инкубации, когда размеры их становятся близки к колониям, вырастающим на щелочном агаре.

В отдельных случаях в посевах могут также встречаться атипичные колонии: мутные с плотным центром, пигментированные (коричневые или светло-желтые), мельчайшие коккоподобные, шероховатые. Следует иметь в виду, что состав и качество питательных сред оказывают влияние на величину и плотность колоний холерных вибрионов, а также на морфологию клеток.

б) При отборе колоний можно использовать пробу на индофенолоксидазу с однокомпонентным реактивом (без альфа-нафтола) с индикаторными бумажками из набора СИБ-1 для идентификации вибрионов или - тест-системы ОКСИ-тест. С колониями, обнаруженными на элективных средах, пробу на оксидазу ставить не рекомендуется.

в) Подозрительные колонии проверяют в слайд-агглютинации с сывороткой холерной О1 в разведении 1:50 - 1:100. При положительной реакции и достаточном количестве подозрительных колоний ставят слайд-агглютинацию с вариантоспецифическими сыворотками Инаба и Огава в том же разведении, приготавливают мазки для окраски по Граму и обработки флюоресцирующими иммуноглобулинами. При отрицательных результатах колонии, обнаруженные в посевах материала от больных, проверяют в слайд-агглютинации с холерными сыворотками О139 и РО.

Положительная ориентировочная реакция агглютинации с холерной О1 сывороткой в разведении 1:100 и вариантоспецифической в разведении 1:50 или положительная реакция с флюоресцирующими иммуноглобулинами в сочетании с морфологическими, культуральными признаками и специфической иммобилизацией позволяют выдать на соответствующем этапе предварительный ответ об обнаружении в исследуемом материале холерного вибриона О1, а в случае положительной реакции с сывороткой О139 - холерного вибриона О139 серогруппы.

г) Подозрительные на вибрионы колонии, агглютинирующиеся и не агглютинирующиеся холерными О1 и О139 сыворотками, отсевают на одну из полиуглеводных сред (лактозо-сахарозная, Ресселя, Клиглера, маннозо-сахарозная или др.) и (или) на сектор пластинки щелочного агара для выделения чистой культуры, ее идентификации и определения чувствительности к антибиотикам.