Лабораторное занятие №1 Введение в иммунологические исследования: основные процедуры иммунологического исследования

Цель работы: освоить базовые методики и процедуры, применяемые при исследовании в области иммунологии.

Оборудование, приборы, принадлежности: центрифуга, термостат, холодильник, автоматические дозаторы на разные объёмы и наконечники к ним, микроскоп, механический счётчик клеток, 24-часовая культура S.aureus, лабораторные пробирки, камера для фиксирования мазков крови, предметные стёкла, иммерсионное масло, краситель Романовского-Гимзы, смесь Никифорова, изотонический раствор NaCl, образцы крови, эритроциты барана.

I. Теоретическая часть

Проведение любых лабораторных процедур предполагает использование специального оснащения, включая лабораторную посуду, лабораторный инструментарий и лабораторное оборудование.

В иммунологических лабораториях использую широкий спектр лабораторной посуды.

Д ля отбора, хранения, центрифугирования биологических образцов, а также проведения иммунологических и биохимических реакций используются:

А) стеклянные или пластиковые пробирки объемом от 5 до 15 мл (рис. 1.1). Пробирки могут быть с круглым или плоским дном, круглого диаметра или конические по форме, иметь специальные крышки. Каждый вид таких пробирок имеет специальные характеристики, требуемые особенностями протокола выполняемой реакции или исследования. Например, при работе с клетками применяют пробирки из материалов, предотвращающих адгезию клеток, либо обрабатывают стеклянные пробирки силиконом. Все пробирки устанавливают в штатив, подходящего размера и с определённым количеством мест для пробирок (рис. 1.2).

Д анные виды пробирок широко применяются для забора первичных биологических образцов жидкости (кровь, лимфа), используются для всех видов иммунологического анализа, пригодны для хранения проб при пониженных температурах, пригодны для кипячения и автоклавирования, используются для центрифугирования;

Б) пластиковые или стеклянные пробирки для микроанализа объемом от 0,5 до 2 мл. Пробирки этого типа могут быть с круглым, плоским или остроконечным дном и иметь специальные крышки (рис. 1.3).Э ти пробирки применяются для всех видов иммунологического анализа, для хранения проб при пониженных и отрицательных температурах. Их можно подвергать автоклавированию (для стерилизации), помещённый в них биологический материал можно центрифугировать в специальных центрифугах;

В ) полистироловые планшеты для микроанализа с круглодонными или плоскодонными лунками (рис. 1.4). Объем лунок составляет 250–300 мкл, планшеты изготавливаются из специального полистирола, обладающего повышенной адсорбционной способностью для фиксирования на поверхности лунок клеток или белковых компонентов иммунохимических систем. Стандартный полистироловый планшет состоит из 96 лунок, расположенных горизонтальными рядами. Лунки имеют буквенную и цифровую нумерацию по горизонтали и вертикали соответственно. Полистироловые планшеты используются для проведения иммунохимического анализа (например, ИФА), а также для клеточных иммунологических тестов.

Кроме 96-луночных планшетов применяют и стрипы. Они представляют собой вариант полистиролового планшета, в котором каждый ряд ячеек фиксируется отдельно на планшетной рамке и анализ может проводиться в небольшом количестве лунок.

Для точного дозирования объемов биологических жидкостей, химических реактивов и компонентов иммунологических тест систем используются:

А ) пипетки мерные стеклянные на полный слив предназначены для отмеривания точного объема жидкости, верхняя отметка соответствует номинальной вместимости, прямые и с расширением. Минимальный точно отмеряемый объем – в пределах 1 мл (рис. 1.5, слева). Пипетки мерные пластиковые с расширением и без также предназначены для точной дозировки компонентов реакционной смеси (рис. 1.5, справа). Минимальный точно отмеряемый объем – в пределах 1 мл.

Б) для точного дозирования малых (и не только) объемов используются полуавтоматические и автоматические дозирующие устройства – пипетки с фиксированным или переменным объемом (рис. 1.6). Минимальный точно отмеряемый объем – в пределах 1 мкл.

Д анные пипетки могут быть одно- и многоканальными, а также иметь электронный блок управления. Пипетки (дозаторы) снабжаются сменными полистироловыми наконечниками.

При работе с автоматической пипеткой необходимо соблюдать следующие правила:

- пластиковый наконечник необходимо плотно зафиксировать на держателе автоматической пипетки;

- во время работы пипетка должна находиться постоянно в вертикальном положении;

- после набора жидкости в наконечник автоматической пипетки категорически запрещается переводить пипетку в горизонтальное положение или оставлять ее на столе;

- при внесении первого компонента иммунохимической реакции в пробирку или в лунку полистиролового планшета наконечник пипетки должен касаться дна пробирки или лунки;

- при внесении каждого последующего компонента иммунохимической реакции в пробирку или в лунку полистиролового планшета наконечник пипетки должен касаться стенки пробирки или лунки над поверхностью жидкости;

- освобождение жидкости из пипетки осуществляется плавным нажатием на поршень до ощутимого упора.

Иммунологические методы исследования являются составной частью общелабораторного дела. Проведение иммунологических методов исследования предполагает владение и использование таких процедур, как взвешивание на разных видах весов, приготовление растворов, расчёт концентраций и массовых объёмов при приготовлении растворов, определение рН растворов, доведение рН приготовленного раствора до необходимого уровня, центрифугирование и многое другое.

Но, кроме общелабораторных, в области иммунологии применяются и специализированные процедуры, без освоения которых невозможно проведение ни одного метода и методики иммунологического исследования.

Эти процедуры охватывают этапы предварительной подготовки исследуемого материала собственно к исследованию и промежуточные процедуры.

Для иммунологического исследования чаще всего используется периферическая кровь. Кроме неё иммунологическому исследованию могут подвергаться самые разные секреты и экскреты организма человека, биоптаты из разных тканей, отделяемое из ран. Но по приемлемости и уровню информативности полученных результатов исследование крови занимает первую позицию.

При иммунологическом исследовании крови изучению подвергают как клетки, так и молекулы, то есть исследуют отдельно клеточную часть крови и её гуморальную фракцию.

Для обеспечения возможности исследования клеточной части крови и её гуморальной фракции взятие крови осуществляют в 2 пробирки: в сухую, стерильную и химически чистую пробирку помещают порцию крови, которая предназначается для получения сыворотки крови. В стерильную, химически чистую пробирку с антикоагулянтом (гепарином, калиевой или натриевой солью ЭДТА) помещают порцию крови, которая не свернётся, и клетки останутся доступными для исследования.

Обычно для иммунологического исследования у человека забирают 10 мл крови: 5 мл для получения сыворотки крови и 5 мл для возможности исследования клеток. Объём забираемой крови может быть увеличен, но нужно помнить о том, что кроме иммунологического исследования, обследуемый человек нуждается и в других анализах, которые также проводятся с использованием крови.

Кровь для исследования забирается путём пункции локтевой вены, обычно натощак, утром. При необходимости кровь для иммунологического исследования забирается и в другое время суток.

Полученную кровь (2 пробирки – для получения сыворотки крови и для исследования клеток) подвергают процедурам предварительной обработки (предобработки):

1) кровь инкубируют для последующего отделения сыворотки крови;

2) в образце крови определяют количество лейкоцитов и лейкоцитарную формулу. Эта информация необходима для дальнейших исследований, она составляет предмет обычного гематологического анализа (или анализа крови), но может быть проведена и самостоятельно в рамках предподготовки образца крови для иммунологического исследования. В этом случае речь идёт об определении концентрации клеток (например, лимфоцитов или нейтрофилов) в подготавливаемой к исследованию суспензии и об определении клеточного состава образца суспензии по морфологии клеток;

3) образец крови с антикоагулянтом подвергают разделению на фракции на градиенте плотности или другим способом.

Процедура получения сыворотки крови

Кровь в количестве 5 мл, помещенную в стерильную, химически чистую, сухую пробирку, оставляют на 2 часа при комнатной температуре для свертывания. Затем стеклянной палочкой отделяют сгусток от стенок пробирки и помещают пробирку на 1 час в холодильник (+4С), центрифугируют 10–15 мин при 1500 об/мин. Сыворотку отбирают в стерильную пробирку. При необходимости образец сыворотки крови сохраняют в течение 2–3-х месяцев в замороженном состоянии (-18 – -20 С). Размораживать образец можно только однократно, поэтому сыворотку одного обследуемого индивида замораживают в несколько порций, используя пластиковые микропробирки на 1,5 мл или меньшего объёма. В сыворотке крови определяют концентрацию иммуноглобулинов и антигенспецифических антител, концентрацию и функциональную активность системы комплемента, концентрацию других иммуноактивных молекул.

Процедура определения количества клеток в исследуемом материале (процедура определения концентрации лейкоцитов в периферической крови) необходима при проведении любой реакции и любого метода с использованием клеток, подвергаемых изучению. Так как образцы клеток ограничены по численности клеток и объёму имеющегося материала, то применяется рутинный подсчёт количества клеток в счётной камере Горяева.

Принцип процедуры заключается в разведении клеточной суспензии значительным объёмом солевого буферного раствора, что снижает концентрацию клеток в суспензии, упрощая их микроскопическую визуализацию при достаточном уровне точности. При определении количества лейкоцитов в крови вместо солевого буферного раствора используют 3–5%-ную уксусную кислоту с добавлением метиленового синего для лизиса эритроцитов, мешающих визуализации лейкоцитов и контрастирования лейкоцитов в поле зрения.

Камера Горяева представляет собой специальное стекло (рис. 1.7), в углублении которого (0,1 мм) нанесена сетка с большими и малыми квадратами строго определенного размера (рис. 1.8).

Р исунок 1.7 Камера Горяева для подсчёта клеток: слева – общий вид, справа – устройство камеры и камера в собранном виде

С етка камеры Горяева изготавливается специальным путём и представляет собой ряд перекрещивающихся линий, образующих большие и малые квадраты (рис. 1.8). Большие квадраты используют для определения количества лейкоцитов, лимфоцитов, а малые – для определения количества эритроцитов, тромбоцитов. Всего в камере Горяева 100 больших квадратов, которые собраны по 4 в группы, располагающиеся по 5 штук по вертикали и горизонтали.

Рисунок 1.8 Сетка камеры Горяева

Перед работой камеру Горяева тщательно протирают сухой салфеткой и притирают к ее поверхности покровное стекло таким образом, чтобы по его краям появились радужные полосы.

Порядок подготовки образца крови для определения их числа (на примере подсчёта лейкоцитов цельной крови): в химическую пробирку вносят 0,4 мл 3% уксусной кислоты. Затем в этот объём уксусной кислоты вносят 0,02 мл (20 мкл) периферической крови. Перемешивают, наблюдая за просветлением раствора за счёт разрушения эритроцитов. После этого переходят к заполнению камеры Горяева суспензией лейкоцитов в уксусной кислоте.

Д ля этого к краю покровного стекла подносят каплю суспензии лейкоцитов пастеровской пипеткой или дозатором (рис. 1.9). Благодаря силам поверхностного натяжения суспензия втягивается в нужном количестве в пространство между камерой Горяева и покровным стеклом. Излишки убирают фильтровальной бумагой.

Рисунок 1.9 Внесение суспензии

Клеток в камеру Горяева

К амеру оставляют на горизонтальной поверхности около 1 минуты для оседания клеток крови и затем микроскопируют на малом увеличении светового микроскопа при опущенном конденсоре и прикрытой диафрагме для лучшего контрастирования клеток. Определение количества лейкоцитов проводят в 100 больших квадратах, переводя поле зрения микроскопа последовательно по всем группам больших квадратов (рис. 1.10). Часто клетки располагаются по границе больших квадратов. В этом случае принимают причисление клеток только по нижней и левой границам или только по верхней и правой границам.

Рисунок 1.10 Слева: общий вид сетки камеры Горяева на малом увеличении (зелёным показано всё рабочее поле, подлежащее исследованию, жёлтым цветов выделена группа из 4 больших квадратов, в которых и сосчитывают лейкоциты). Справа: лейкоциты в больших квадратах (большое увеличение), показана методика включения лейкоцитов, располагающихся по границе больших квадратов – к сосчитываемым причисляют те клетки, которые располагаются только по нижней и левой границе (красный пунктир) или по верхней и правой границе (синий пунктир)

Обычно определение количества клеток в камере Горяева проводят с использованием клавишного механического счётчика клеток (рис. 1.11, существуют их разные модели). Увиденную клетку регистрируют, делая нажатие на клавишу, при этом прибор фиксирует это нажатие прибавлением 1. В конце исследования всех 100 квадратов достаточно прочесть образованное число на панели счётчика.

Р исунок 1.11 Некоторые модели механического счётчика клеток крови

Расчет количества лейкоцитов в 1 мкл крови проводят, исходя из разведения крови (20), числа сосчитанных квадратов (100) и объема 1 большого квадрата (1/250 мкл), по следующей формуле:

X= (a 250  20) / 100 = a 50, где а – количество сосчитанных лейкоцитов. Для определения количества лейкоцитов в 1 мл или в 1 л крови полученный показатель соответственно умножают на 10³ или 10⁶.

Процедура морфологической идентификации клеток крови в микроскопическом препарате, окрашенном стандартным методом, применяется для оценки степени гомогенности популяционного состава приготавливаемой суспензии клеток. Например, фагоцитоз удобнее изучать на суспензии изолированных нейтрофилов. Промежуточное исследование подготавливаемой суспензии помогает понять качество последующего результата.

В рамках обычного анализа крови эту процедуру используют для определения так называемой лейкоцитарной формулы, то есть выраженного в процентах по каждой популяции лейкоцитов состава.

Для приготовления микроскопического препарата каплю крови наносят на край предметного стекла (сухого и тщательно обезжиренного), плотно прикасаются к ней краем шлифованного стекла – кровь распределяется по его длине. Быстрым движением растягивают кровь по всей поверхности предметного стекла – микроскопический препарат крови готов после высыхания к дальнейшей обработке.

Приготовленный мазок крови высушивают на воздухе и фиксируют, помещая предметное стекло в ёмкость с фиксатором. Фиксация осуществляется спиртами или иными специальными составами, от которых зависит время фиксации. При использовании метанола достаточно 5 минут инкубации, при использовании этанола или смеси Никифорова (этанол:эфир = 1:1) – 15 минут.

Затем мазок помещают в кювету с красителем либо наливают краситель на препарат. В основном для окрашивания мазков крови используют краситель Романовского-Гимзы, азур II-эозин, краситель Май-Грюнвальд. Время окрашивания определяют для каждой серии красителя опытным путем, обычно оно составляет 20–30 минут. После окрашивания мазок промывают водой, просушивают фильтровальной бумагой и микроскопируют на масляной иммерсии на большом увеличении светового микроскопа.

Микроскопию начинают, отступя 3–5 полей зрения от края мазка и передвигаясь по нему в перпендикулярных направлениях, проходя по 3–5 полей зрения. Для регистрации результатов используют 11-клавишный счетчик клеток (рис. 1.11). Всего подсчитывают не менее 100 лейкоцитов, определяя по счетчику процентное содержание каждой популяции.

При идентификации клеток крови использую морфологические признаки клеток (табл. 1.1).

Таблица 1.1.

Морфологическая характеристика лейкоцитов периферической крови человека

Параметр	Нейтрофилы		Эозинофил	Базофилы	Моноциты	Лимфоциты
	п/я	с/я
Размер, мкм	10–15	10–15	12–15	8–12	15–20	7–10
Ядро: форма	узкое, вытянутое в виде палочки	узкое, состоит из 3–5 сегментов	Шире, чем у нейтрофила, состоит из 2–3 сегментов	неопределенное, иногда в виде листа растения	полиморф-ноеокруглое, бобовидное с вдавлениями	округлое или бобовидное
структура	неравномерная или крупноглыбчатая				равномерная сетчатая	неравномерная крупно-глыбчатая
окраска	тёмно-фиолетовая		фиолетовая		светло-фиолетовая	темно-фиолетовая
Цитоплазма	розоватая		бледно-розовая		обильная бледно-голубая или сероватая	в виде узкого ободка иногда широкая зона, голубая
Зернистость, ее окраска, характер	обильная, мелкая, светло-фиолетовая		обильная, крупная, розовая	необильная, неравно- мерная, фиолетовая	непостоянная иногда мелкая, бледно-фиолетовая	изредка единичные фиолетовые гранулы

Процедура разделения крови на фракции клеток на градиенте плотности фиколл-верографин

Градиент плотности – это раствор определенного вещества, имеющего при разной концентрации разную плотность, которая может быть измерена специальным прибором – ареометром, и способные обеспечить оптимальные для клеток условия осмотичности среды.

Градиенты плотности широко применяются в разных областях медико-биологических наук. Так, в биохимии для выделения митохондрий и др. субклеточных органелл применяют градиент из раствора сахарозы, в вирусологии для выделения вирионов – из растворов солей кремния или цезия. В иммунологии наиболее широко применяют растительный полисахарид – фиколл, дополняемый рентгенокотрастным препаратом верографином (визотрастом и проч.), а также растворы перколла (частицы кремния диаметром 15–30 нм, покрытые поливинил-пирролидоном). Многие фирмы выпускают готовые градиенты плотности с заданными свойствами, либо их можно приготовить из отдельных ингредиентов. При этом рассчитывают необходимое количество порошка градиента, растворяют его в дистиллированной воде, проверяют плотность и при необходимости стерилизуют.

Метод выделения мононуклеаров основан на разной плавучести различных форменных элементов крови. Применение градиента определенной плотности (таблица 1.2) позволяет отделить мононуклеары (лимфоциты, моноциты, бластные клетки) от эритроцитов и гранулоцитов.

Таблица 1.2

Используемые градиенты плотности при выделении клеток человека

(Cell separation methods and applications, edited by D.Recktenwald, 1997)

Тип клеток	Плотность градиента, г/см3
Лимфоциты (Т- и В-)	1,077
Моноциты	1,064
Гранулоциты	1,093
NK-лимфоциты	1,06
Эритроциты	1,115

В результате центрифугирования суспензии клеток на градиенте плотности, происходит разделение клеток на фракции, схематично представленное на рис. 1.12.

Рисунок 1.12 Седиментация клеток периферической крови при центрифугировании на градиенте плотности 1,077 г/см³

Разделение клеток крови на градиенте плотности приводит к тому, что каждый тип клеток находится на том или ином месте градиента, откуда нужные клетки можно изъять пастеровской пипеткой или обычным дозатором в отдельную пробирку.

В большинстве ситуаций выделенные клетки требуют процедуры отмывания для избавления от примесей в виде обломков клеток и ненужных веществ (белки плазмы крови, вещество градиента). После отмывания определяют концентрацию клеток. При необходимости изучают морфологию клеток для понимания степени гомогенности выделенной клеточной популяции.

Процедура отмывания клеток буферным солевым раствором или изотоническим раствором хлорида натрия

В пробирку с отмываемыми клетками добавляют отмывающий буферный раствор (обычно к осадку клеток добавляют 10 мл отмывающего буферного раствора), клетки ресуспендируют последовательным набором жидкости с последующим выпусканием назад, избегая появления пузырей, которые повреждают клетки. Затем пробирку с клеточной суспензией подвергают центрифугированию. Режим центрифугирования зависит от вида отмываемых клеток и общего объёма отмываемой суспензии. При отмывании эритроцитов применяют центрифугирование при 3000 об./мин в течение 10 минут, при отмывании лимфоцитов – 1500 об./мин в течение 5–7 минут.

После центрифугирования клетки оседают на дне пробирки, образуя клеточный осадок. Сверху располагается супернатант. Он содержит клеточные обломки, молекулы разных веществ. Супернатант при отмывании эритроцитов окрашен в розовато-оранжевый цвет за счёт выделившегося из разрушенных эритроцитов гемоглобина.

Супернатант изымают из пробирки. Иногда для этого достаточно перевернуть пробирку, и супернатант выливается из неё, но чаще его убирают дозатором или пастеровской пипеткой.

Обычно клеточную суспензию подвергают 2–3-кратному отмыванию. При последнем отмывании супернатант должен быть совершенно прозрачным.

После последнего отмывания осадок выделенных клеток разводят 1 мл питательной среды или буферного раствора. Тщательно ресупендируют и определяют число клеток для того, чтобы понять, какой численностью клеток мы располагаем для дальнейшего исследования и как осуществить разведение этой клеточной суспензии для доведения её концентрации до уровня, требуемого по методике исследования.

Процедура расчёта для приготовления клеточной суспензии нужной концентрации или растворов жидкостей

В отмытой и приготовленной в 1 мл буферного солевого раствора или питательной среды суспензии клеток определяют их концентрацию по приведенной выше методике в камере Горяева. Так как приготовленная суспензия клеток занимает объём в 1 мл, то определённая в камере Горяева концентрация отражает абсолютное число имеющихся клеток.

Если методика, проведение которой планируется выполнить с этими клетками, требует концентрации клеток ниже, чем полученное значение, то имеющееся количество клеток разводят тем же буферным раствором или питательной средой до достижения нужной концентрации.

Например, в процессе выделения лимфоцитов на градиенте плотности фиколл-верографин, после отмывания суспензии и доведения её объёма до 1 мл получено 20 млн. клеток. Предполагаемая в проведении методика требует использовать суспензию лимфоцитов в концентрации 2 млн. клеток в 1 мл. Значит, имеющуюся суспензию нужно развести в 10 раз.

Этого можно достигнуть двумя путями: к имеющемуся 1 мл суспензии лимфоцитов добавить 9 мл буферного раствора или питательной среды (до общего объёма 10 мл). Второй путь заключается во внесении 0,1 мл суспензии клеток в 0,9 мл буферного раствора или питательной среды.