II. Методические указания к выполнению лабораторной работы

1. Освоить методику приготовления смыва микробной суспензии.

2. Осуществить постановку реакции фагоцитоза.

3. Провести микроскопический учет реакции фагоцитоза.

4. Рассчитать показатели фагоцитарной активности нейтрофилов.

5. Изучить демонстрационные препараты фагоцитоза. Зарисовать и дать по ним заключение.

6. Сдать отчёт преподавателю и защитить его.

III. Содержание отчёта

Отчёт должен быть представлен на отдельных листах формата А4 или в альбоме.

Отчёт должен содержать следующие пункты:

1. Цель работы.

2. Краткое описание этапов приготовления микроскопического препарата.

3. Результаты исследований (схема постановки реакции по исследованию фагоцитоза нейтрофилами суспензии стафилококка, микроскопическое изучение препаратов с их зарисовкой и заключением).

4. Выводы.

Отчёт на листе формата А4 (или в альбоме) сдаётся в конце работы преподавателю.

IV. Контрольные вопросы

1. Клетки-участники фагоцитарного процесса.

2. Этапы фагоцитоза.

3. Объекты фагоцитоза.

4. Исход фагоцитоза.

5. Физиологическая роль фагоцитоза.

Список литературы:

1. Лекционный материал.

2. Ярилин, А. А. Иммунология: учебник / А. А. Ярилин – М.: ГЕОТАР-Медиа, 2010. – С.122-149.

3. Хаитов, Р. М. Иммунология: Учебник / Р. М. Хаитов, Г. А. Игнатьева, И. Г. Сидорович. – М.: Медицина, 2000. – С. 61-67.

4. Плейфэр, Дж. Наглядная иммунология: пер. с англ. / Дж. Плейфэр – М.: ГЭОТАР МЕДИЦИНА, 2000. – С. 20-23.

Лабораторное занятие № 3 Гуморальные факторы видового иммунитета: система комплемента. Методы изучения системы комплемента

Цель работы: освоить метод 50%-го гемолиза для определения общей активности системы комплемента.

Оборудование, приборы, принадлежности: термостат, холодильник, спектрофотометр, центрифуга, автоматические дозаторы на разные объёмы и наконечники к ним, штативы для пробирок, химические пробирки на 10 мл, мединал-вероналовый буфер, изотонический раствор хлорида натрия, суспензия эритроцитов барана, гемолитическая сыворотка, дистиллированная вода, образцы сыворотки крови человека для исследования активности системы комплемента.

I. Теоретическая часть

Исследование системы комплемента представляет собой существенную проблему в силу особенностей её структурно-функциональной организации, включающей компонентный состав системы и каскадный механизм вовлечения компонентов в реакцию активации.

Наиболее приемлемым подходом оценки функциональной активности системы комплемента является биологический. Этот подход заключается в создании в условиях in vitro возможности проявления активности системой комплемента тестируемого образца крови (сыворотки крови) путём предоставления системе комплемента мишеней для сборки мембраноатакующего комплекса. По разрушению того или иного количества этих мишеней регистрируют активность системы комплемента в образце сыворотки крови.

Самыми доступными мишенями являются эритроциты барана, мыши, кролика или других видов животных. Их цитоплазматическая мембрана содержит полисахариды, активирующие комплемент. Эритроциты можно использовать и для создания комплекса антиген-антитело, являющегося основным активатором классического пути. В результате активации системы комплемента происходит лизис эритроцитов (гемолиз), по степени которого устанавливается активность системы комплемента тестируемого образца сыворотки крови. Поэтому данный метод получил название гемолитического.

В процессе проведения гемолитического метода оценки активности комплемента невозможно определить прямые количественные параметры, например, концентрацию компонентов комплемента. Определяемым параметром становится условная единица – единица СН50, которая подразумевает способность определённого количества сыворотки крови, в которой находится некоторое количество комплемента, лизировать определённую часть эритроцитов-мишеней, представленных в виде суспензии, в течении отведённого как инкубация времени.

Д ля достижения возможности определения единиц СН50 из тестируемой сыворотки крови создают ряд разведений, когда в каждой последующей пробирке находится увеличенная в сравнении с предыдущей пробиркой порция сыворотки (рис. 3.1)

Рисунок 3.1 Ряд разведений сыворотки крови для исследования активности комплемента методом 50%-го гемолиза

Порция сыворотки крови смешивается с содержащимся в пробирке буферным раствором. Это приводит к нарастающему увеличению концентрации компонентов в ряду последующих пробирок. То есть, в каждой последующей пробирке больше комплемента, чем в предыдущей, что и определяет возможность регистрации активности системы комплемента в условных единицах СН50.

Затем в каждую пробирку добавляют определённый объём суспензии эритроцитов – мишеней для проявления активности системы комплемента. Эту суспензию называют «гемолитической системой», или гемсистемой.

Г емсистемы для оценки активности классического и альтернативного путей активации комплемента (рис. 2.2) различны: гемсистема для альтернативного пути представляет собой суспензию эритроцитов кролика или мыши в забуференном фосфатами солевом растворе (PBS), а гемсистема для классического пути – это суспензия эритроцитов барана, сенсибилизированных антителами к их мембране, желатин-вероналовом буфере с ионами кальция (рис. 3.2).

Рисунок 3.2 Гемолитические системы для исследования альтернативного (А) и классического (Б) путей активации системы комплемента.

В литературе принято обозначение гемсистемы для исследования классического пути активации системы комплемента – ЕА (erythrocyte–antybody, эритроцит-антитело к нему).

П ри высоком содержании в тестируемом образце сыворотки крови комплемента уровень его активации на эритроцитах-мишенях будет высок, а, следовательно, степень гемолиза эритроцитов будет значительна (рис. 3.3).

Рисунок 3.3 Гемолиз при проявлении комплементом активности: в ряду от а) до д) нарастает количество лизированных эритроцитов. Из них выходит гемоглобин, что придаёт среде оранжево-красный цвет, а количество целых эритроцитов уменьшается.

Определение активности комплемента исследуемого образца сыворотки крови в условных единицах подразумевает сравнение каждой пробирки опытного ряда с контрольной пробиркой, в которой лизировано 50% эритроцитов гемсистемы. Этот контроль приготавливают добавлением в гемсистему дистиллированной воды (рис. 3.4).

Рисунок 3.4 Методический подход к определению уровня СН50 в исследуемом образце сыворотки крови: приготовленный контроль, в котором лизировано 50% эритроцитов гемсистемы, имеет определённую степень окраски в силу выхода в раствор гемоглобина из лизированных эритроцитов. Этот контроль соответствует 1 условной единице СН50. Контроль сравнивают с каждой опытной пробиркой для определения в ряду пробирок той, которая соответствует по цвету раствора контрольной.

Регистрацию результатов исследования активности системы комплемента методом СН50 проводят спектрофотометрированием супернатанта каждой пробирки опытного ряда, а при отсутствии спектрофотометра осуществляют визуальное сравнение опытных пробирок с контрольной.