Условия приготовления реагентов

1. Моноспецифические сыворотки, содержащие антитела к иммуноглобулинам А, М, G растворяем в 1 мл стерильного физраствора.

2. 3% агарозный гель готовят из 6 г сухой агарозы, растворенной при нагревании на водяной бане в 100 мл дистиллированной воды и в 100 мл веронал-мединалового буфера с последующим добавлением 4 мл 1% раствора мертиолата в качестве консерванта.

3. Окрашивающую жидкость готовят из 1 г красителя амидо-черный, растворенного в 100 мл ледяной уксусной кислоты с последующим увеличением объема до 1000 мл дистиллированной водой и фильтрованием.

Условия проведения реакции

В подогретый на водяной бане до +40 – +43ºС агар вносим антисыворотку, определив ее объем, исходя из титра, указанного на ампуле. Выливаем агар на подогретое до 30ºС предметное стекло и оставляем на 10 минут для застывания смеси. Пробойником вырезаем лунки и выбираем из них гель.

Разводим стандарты. Для определения IgA и IgM используется ряд: цельный стандарт, разведения 1:2, 1:4, 1:8, 1:16. Для IgG используются разведения стандарта 1:4, 1:8, 1:16, 1:32, 1:64.

Разводим исследуемые образцы сыворотки крови. Для определения IgA и IgM разведение сыворотки должно быть 1:4, а для IgG – 1:16. Такие различия связаны с необходимостью соблюдения эквивалентного соотношения антигена и антител в системе и различиями в концентрации иммуноглобулинов разных классов в сыворотке крови.

Вносим в лунки стандартные сыворотки и исследуемые образцы. Оставляем залитые пластины на 24 часа во влажной камере в термостате для осуществления диффузии и образования преципитатов.

Промываем пластины изотоническим раствором хлорида натрия или водой для вымывания несвязавшихся белков, высушиваем и окрашиваем раствором амидо-черного 10В.

Регистрация результатов

На окрашенных пластинах специальной клиновидной линейкой проводят измерение диаметра полученных колец преципитации (рис. 5.1, В) для разведения стандартной сыворотки и исследуемых препаратов биологических жидкостей. По результатам измерения колец преципитации стандартной сыворотки строят калибровочные кривые для каждого иммуноглобулина, где по оси абсцисс откладывают диаметры колец преципитации в мм, а по оси ординат – известную концентрацию данного иммуноглобулина в мг/мл, содержащуюся в данном разведении сыворотки. Концентрацию иммуноглобулинов в исследуемых препаратах определяют с использованием полученных калибровочных кривых. В последнее время для расчета концентрации Ig используют компьютерные программы.

Концентрация Ig в сыворотке крови (физиологические уровни)

IgM: 0,4–2,2 г/л IgA: 0,7–4,0 г/л IgG: 6,0–16,0 г/л IgE: не более 0,00025 г/л

II. Методические указания к выполнению лабораторной работы

1. Освоить методику постановки реакции простой радиальной иммунодиффузии.

2. Проведите заливку агарозным гелем стёкол или чашки Петри. После застывания подготовьте слой агарозы для внесения образцов исследуемых сывороток крови и стандартных разведений.

3. Приготовьте разведения стандартных сывороток и исследуемых образцов. Внесите стандартные сыворотки и исследуемые образцы в лунки в слое агарозы.

4. Проведите отмывание и окраску пластин после завершения иммунодиффузии.

5. Осуществите учёт реакции радиальной иммунодиффузии по Манчини.

6. Сдать отчёт преподавателю и защитить его.