II. Методические указания к выполнению лабораторной работы

1. Освоить методику постановки реакции агглютинации на стекле.

2. Провести антигенную идентификацию чистой культуры бактерий в РА.

3. Освоить методику постановки РПГА в пробирках.

4. Поставить РПГА в пробирках для определения титра антител к вирусу кори.

5. Учесть результаты проведенных реакций, проанализировать их.

6. Зарисовать механизмы формирования агглютинатов и преципитатов.

7. Сдать отчёт преподавателю и защитить его.

III. Содержание отчёта

Отчёт должен быть представлен на отдельных листах формата А4 или в альбоме.

Отчёт должен содержать следующие пункты:

1. Цель работы.

2. Краткое описание этапов постановки реакций агглютинации и пассивной гемагглютинации.

3. Результаты исследований (зарисовка схемы механизма формирования агглютинатов и преципитатов, схемы постановки РА и РПГА, расчётные данные, учёт результатов).

4. Выводы.

Отчёт на листе формата А4 (или в альбоме) сдаётся в конце работы преподавателю.

IV. Контрольные вопросы

1. Строение молекулы антигена.

2. Виды антигенов.

3. Антитела: строение, функциональные участки.

4. Механизмы взаимодействия антиген-антитело.

5. Функции антител.

Список литературы:

1. Лекционный материал.

2. Ярилин, А. А. Иммунология: учебник / А. А. Ярилин – М.: ГЕОТАР-Медиа, 2010. – С. 231-242, 263-298.

3. Хаитов, Р. М. Иммунология: Учебник / Р. М. Хаитов, Г. А. Игнатьева, И. Г. Сидорович. – М.: Медицина, 2000. – С. 71-107.

4. Новиков Д. К. Медицинская иммунология: учеб. пособие / Д. К. Новиков. – Мн.: Выш. шк., 2005. – С. 56-69, С. 100-117.

5. Плейфэр, Дж. Наглядная иммунология: пер. с англ. / Дж. Плейфэр – М.: ГЭОТАР МЕДИЦИНА, 2000. – С. 36-40, С. 44-45.

Лабораторное занятие № 5 Взаимодействие антиген-антитело и методы его регистрации: преципитация, простая радиальная иммунодиффузия по Манчини

Цель работы: изучить постановку реакции комплекса преципитации, освоить количественный подход к определению концентраций иммуноглобулинов в биологических средах.

Оборудование, приборы, принадлежности: термостат, холодильник, центрифуга, автоматические дозаторы на разные объёмы и наконечники к ним, 96-лучноные планшеты или стрипы, стёкла для заливки агарозой, мединал-вероналовый буфер, изотонический раствор хлорида натрия, диагностические антисыворотки, агарозный гель, пробойник для изготовления лунок, исследуемые образцы сыворотки крови.

I. Теоретическая часть

Установление концентрации иммуноглобулинов разных классов в биологических жидкостях (сыворотке крови, слюне и проч.) имеет важное диагностическое и научное значение. Поэтому для количественного определения концентрации IgG, A, M, E разработаны специальные методы, включая реакцию простой радиальной иммунодиффузии по Манчини.

Эта реакция основана на феномене преципитации, т. е. образовании крупного белкового конгломерата, состоящего из комплексов антиген-антитело, и видимого невооруженным глазом.

Антигеном в данном случае являются собственно иммуноглобулины каждого класса. Так как иммуноглобулины (например, человека) – это белки, то для другого вида животных они являются антигеном и при введении в организм индуцируют гуморальный иммунный ответ с синтезом антител. То есть, иммунизируя иммуноглобулинами человека животных (овец, коз или кроликов), можно получить диагностический компонент – антитела к иммуноглобулинам определенных классов человека. Этот диагностический компонент называется антисывороткой к иммуноглобулину человека определенного класса и выпускается специальными предприятиями и лабораториями.

Данный диагностический компонент (антисыворотку к IgG, например, или к IgA, или к IgM) в определенном количестве (в титре) вносят в агаровый или агарозный гель. Температура геля в этот момент должна быть на уровне +40 – +43С (при более высокой температуре диагностические антитела коагулируют, а при более низкой гель застывает и введенные диагностические антитела не перемешиваются и не распределяются в геле равномерно). Агаровый гель с внесенной диагностической антисывороткой перемешивают и распределяют эту смесь на стеклянных пластинах. Толщина агарового слоя должна составлять 1 мм.

После застывания в агаровом геле с помощью специального пробойника делают лунки диаметром 1,5–2 мм, в которые вносят исследуемый материал. Исследуемый материал всасывается в агаровый слой. При наличии в исследуемом образце иммуноглобулинов соответствующего класса происходит реакция взаимодействия антиген (иммуноглобулин определяемого класса исследуемого образца) – антитело (диагностическая антисыворотка, или антиIg определенного класса). В последующем, благодаря особенностям строения молекул Ig, возникает укрупнение комплексов за счет объединения нескольких в единый комплекс, т. е. образование преципитатов. Визуально преципитаты видны невооруженным глазом как мутные зоны на фоне более прозрачного агарового слоя (рис. 5.1, А). Для лучшего контрастирования преципитатов пластины окрашивают красителями, связывающимися с белками (рис. 5.1, Б). Площадь преципитата соответствует количеству определяемых Ig. Для количественного определения концентрации иммуноглобулинов какого-либо класса необходимо иметь стандартный образец, содержащий известную концентрацию Ig разных классов. Такие стандартные образцы также выпускаются специальными предприятиями и прилагаются к набору диагностических антисывороток. Стандартный образец вносят в ряд лунок, приготовив предварительно разведения образца для получения концентраций, отличающихся друг от друга в 2 раза. Благодаря этому после диффузии получается ряд преципитатов разной площади, что позволяет построить калибровочный график и определить концентрацию иммуноглобулина в исследуемых образцах.

Рисунок 5.1 Внешний вид преципитатов при постановке реакции Манчини для определения концентрации иммуноглобулинов в сыворотке крови: А – нативный препарат, Б – окрашенные преципитаты, В – методика измерения диаметра преципитата клиновидной линейкой (увеличено).