Проведение метода сн50

1. Для исследования используется сыворотка крови (см. лабораторную работу №1).

2. Приготовление гемолитической системы.

Для приготовления гемсистемы использую суспензию эритроцитов барана/кролика, отмытую от лизированных эритроцитов. Из плотного осадка эритроцитов готовят 3%-ную (по объему) взвесь в изотоническом растворе. Например, для приготовления 10 мл 3%-ной суспензии эритроцитов надо взять 0,3 мл эритроцитов (плотного осадка) и 9,7 мл изотонического раствора хлорида натрия.

Гемолитическая система для тестирования классического пути активации системы комплемента – это смесь равных объемов 3%-ной взвеси бараньих эритроцитов и гемолитической сыворотки, взятой по троекратному титру (т. е. в количестве достаточном для опсонизации эритроцитов, но недостаточном для полного связывания всех эритроцитов, т.е. для их агглютинации).

Гемолитическая сыворотка представляет собой антитела к эритроцитам барана, представленные IgG, выпускаемые специализированными предприятиями. Для ее получения проводят иммунизацию лабораторных животных, например лошадей, кроликов, коз. Иммунизация, т. е. искусственное введение в организм антигена (в данном случае – эритроцитов барана) приводит к развитию гуморального иммунного ответа с продукцией антигенспецифических антител. Гемолитическая сыворотка используется для постановки широкого спектра иммунологических реакций, включая определение активности комплемента.

Смешивание гемолитической сыворотки с эритроцитами производят по возможности быстро, причем гемолитическую сыворотку примешивают к взвеси эритроцитов, а не наоборот. Смесь выдерживают при 37ºС в термостате 30 мин для сенсибилизации эритроцитов.

Гемолитическая система для тестирования активности альтернативного пути – это 3 %-ная суспензия эритроцитов кролика в изотоническом фосфатном буфере.

3. Постановка реакции осуществляется следующим образом:

а) исследуемую сыворотку разводят буферным раствором в 10 раз: 1 мл сыворотки + 9 мл буферного раствора;

б) нумеруют рабочий ряд пробирок;

в) исследуемую сыворотку разливают по пробиркам в возрастающем объёме согласно приведенной схеме, затем уравнивают объемы вероналовым буфером и вносят гемсистему.

Схема внесения реактивов для постановки метода СН50 в ряд пробирок

Ингредиент	Пробирки
	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11
Иссл. с-ка мл	0,05	0,1	0,15	0,2	0,25	0,3	0,35	0,4	0,45	0,5	–
Буфер мл	1,45	1,4	1,35	1,3	1,25	1,2	1,15	1,1	1,05	1	1,5
Гем. система мл	1,5	1,5	1,5	1,5	1,5	1,5	1,5	1,5	1,5	1,5	1,5

г) отдельно приготавливают стандарт по 50%-му гемолизу:

Приготовление стандарта гемолиза для метода СН50

ингредиенты	пробирки
	1	2	3	4	5	6	7	8
Гемсистема, мл	0,2	0,3	0,4	0,5	0,6	0,7	0,8	0,9
Дистилированная вода, мл	0,8	0,7	0,6	0,5	0,4	0,3	0,2	0,1
% гемолиза	20	30	40	50	60	70	80	90

Таким образом, пробирка 4 – стандарт 50% гемолиза;

д) все пробирки инкубируют при + 37С в течение 30 минут, что необходимо для активации классического пути системы комплемента;

е) для остановки реакции все пробирки ставят в холодильник на 10 мин;

ж) все пробирки центрифугируют при 2000 об./мин 10 минут.

Регистрацию результатов проводят либо визуально, сравнивая цвет супернатанта опытных пробирок со стандартом (контрольное разведение), но лучше – с помощью спектрофотометра (измерение проводят на длине волны поглощения гемоглобина, 412–432 нм). Определяют гемолитическую активность системы комплемента, выражая ее в условных единицах СН50.

Например, интенсивность окраски супернатанта стандарта наиболее близка к интенсивности окраски супернатанта 5-й опытной пробирки, в которой содержится 0,25 мл сыворотки, тогда – 0.25 мл – это 1 единица СН50,

а 1 мл сыворотки - это х единиц СН50,

составив пропорцию, получаем результат:

4 СН50, но так как сыворотка исходно была разведена в 10 раз, то умножаем 4 СН5010 = 40 СН50.