II. Методические указания к выполнению лабораторной работы

1. Освоить методику приготовления гемсистемы.

2. Осуществить постановку реакции 50%-го гемолиза.

3. Провести учет реакции 50%-го гемолиза.

4. Рассчитать активность системы комплемента в тестированных образцах сыворотки крови.

5. Зарисовать полученные результаты.

6. Сдать отчёт преподавателю и защитить его.

III. Содержание отчёта

Отчёт должен быть представлен на отдельных листах формата А4 или в альбоме.

Отчёт должен содержать следующие пункты:

1. Цель работы.

2. Краткое описание этапов постановки метода 50%-го гемолиза.

3. Результаты исследований (зарисовка схемы гемолиза эритроцитов барана комплементом исследуемых образцов сыворотки крови, зарисовка полученных результатов, расчёт активности системы комплемента).

4. Выводы.

Отчёт на листе формата А4 (или в альбоме) сдаётся в конце работы преподавателю.

IV. Контрольные вопросы

1. Состав системы комплемента: компоненты, номенклатура, биосинтез.

2. Пути активации: альтернативный, классический, лектинный.

3. Функции системы комплемента.

Список литературы:

1. Лекционный материал.

2. Ярилин, А. А. Иммунология: учебник / А. А. Ярилин – М.: ГЕОТАР-Медиа, 2010. – С.166-181.

3. Хаитов, Р. М. Иммунология: Учебник / Р. М. Хаитов, Г. А. Игнатьева, И. Г. Сидорович. – М.: Медицина, 2000. – С. 50-60.

4. Новиков Д. К. Медицинская иммунология: учеб. пособие / Д. К. Новиков. – Мн.: Выш. шк., 2005. – С. 81-85.

Лабораторное занятие № 4 Взаимодействие антиген-антитело и методы его регистрации: агглютинация

Цель работы: изучить визуальные феномены взаимодействия антиген-антитело и методы, основанные на этом взаимодействии (серологический, иммунохимический).

Оборудование, приборы, принадлежности: термостат, холодильник, спектрофотометр планшетный, центрифуга, автоматические дозаторы на разные объёмы и наконечники к ним, 96-лучноные планшеты, химические пробирки на 10 мл, предметные стёкла, мединал-вероналовый буфер, изотонический раствор хлорида натрия, диагностические сыворотки и диагностикумы, культура бактерий, исследуемые образцы сыворотки крови.

I. Теоретическая часть

Взаимодействие антигена и специфичного ему антитела приводит к связыванию этих молекул с образованием иммунного комплекса (ИК). Но в зависимости от особенностей строения взаимодействующих молекул иммунные комплексы имеют существенные различия.

Е сли молекула антигена имеет одну антигенную детерминанту (эпитоп), то антиген может связаться только одним паратопом одной молекулы антитела (рис. 4.1). Но если в молекуле антигена есть две и более антигенные детерминанты, то такие антигены могут образовать сложный иммунный комплекс с участием более чем одной молекулы антитела.

Рисунок 4.1 Особенности строения антигена, допускающие образование крупных многомолекулярных агрегатов: слева (на сером фоне) представлен антиген с одной антигенной детерминантой, справа (на белом фоне) – антиген с несколькими антигенными детерминантами (поливалентный). Такой антиген может стать сайтом связывания нескольких молекул антител с образованием крупного белкового агрегата.

Именно такие антигены инициируют формирование крупных многомолекулярных агрегатов, образование которых можно увидеть невооружённым глазом как феномены агглютинации и преципитации (рис. 4.2).

Рисунок 4.2 Феномены агглютинации и преципитации

Феномены агглютинации и преципитации объединены единым механизмом, который приводит в возможности регистрации образования агрегата иммунных комплексов невооружённым глазом. Но эти феномены имеют и существенные различия: агглютинация возникает при связывании специфичными антителами корпускулярного, водонерастворимого антигена, тогда как преципитация образуется при связывании специфичными антителами водорастворимого антигена. На основании этого различия имеется классификация антител, согласно которой выделяют агглютинирующие антитела (агглютинины) и преципитирующие антитела (преципитины).

Примерами реакции агглютинации являются такие, как определение групп крови (на эритроцитах представлены антигены, то есть антиген корпускулярный), а также определение антигенной структуры бактерий, выполняемое в рамках антигенной идентификации чистой культуры.

Реакции преципитации широко применяются в медицинской диагностике (определение С-реактивного белка, концентрации иммуноглобулинов в биологических жидкостях и др.) и в криминалистике.

Агглютинация и преципитация составляют основу серологического метода исследования, позволяющего определение антигена по известным антителам или определение антител по известному антигену.

Серологический метод характеризуется высокой чувствительностью и специфичностью. Большинство реакций этого метода просты в проведении и учете, доступны широкому кругу лабораторий, как правило, безопасны, экономичны, поддаются стандартизации.

Серологический метод предполагает проведение серологической реакции. Спектр серологических реакций в настоящее время широк. Всем им присущи общие особенности:

1) так как любые серологические реакции являются реакциями взаимодействия антигена и антитела, то во всех случаях для установления присутствия антител в исследуемом материале необходим набор известных стандартных корпускулярных или растворимых антигенов, называемых диагностикумами. В свою очередь, для установления присутствия антигена нужен набор иммунных диагностических сывороток (антительный диагностикум);

2) взаимодействие антигена и антитела осуществляется только в присутствии электролита, в качестве которого обычно используют изотонический раствор хлорида натрия или буферные смеси с необходимым уровнем рН;

3) для образования иммунного комплекса (Аг-Ат) требуется период инкубации при определённой температуре (от +4С; +37 С): образование видимого простым глазом агглютината или преципитата происходит медленно, через несколько часов или даже суток;

4) оба компонента серологической реакции (антиген и антитела) должны присутствовать в эквивалентном соотношении. Избыток какого-либо из компонентов блокирует образование иммунного комплекса и приводит к ложным результатам.

Для расширения возможности применения феномена агглютинации в целях диагностики и исследований в серологический метод введён приём перевода водорастворимого антигена в корпускулярный. Он осуществляется путём сорбирования водорастворимого антигена на нейтральных корпускулах (частицах латекса размером в пределах от 1 до 7 мкм), эритроцитах барана и др. Такие реакции агглютинации называются пассивными (реакция пассивной гемагглютинации – РПГА, реакция латекс-агглютинации).

Результат серологической реакции регистрируют (учитывают) по факту образования агглютинации или преципитации. В иммунологии принята система «четырёх плюсов» для учёта любых серологических реакций (табл. 4.1). Эта система основана на регистрации уровня связывание антигена антителами – от 100% (полное связывание антигена, что означает достаточность антител исследуемого материала) до 25% (связано не более ¼ части содержащегося антигена) до отсутствия феномена агглютинации или преципитации. Адекватный учёт серологической реакции возможен только при наличии контролей – положительного, формируемого на основе связывания диагностического компонента с так называемым «положительным стандартом» (прилагаемый к набору реактивов образец антител к данному диагностикуму) и отрицательного. Положительный и отрицательный контроли позволяют провести сравнение достигнутого при постановке реакции агглютината или преципитата с их выраженностью, характерной для эталона, представляемого контролями.

Таблица 4.1

Система учёта серологической реакции по феномену агглютинации и преципитации

Результат реакции	Показатели
	связывание Аг	образование белковых конгломератов	состояние жидкой фракции системы	характеристика результатов
++++	полное, 100%	массивное, конгломераты не распадаются при встряхивании пробирок	совершенно прозрачный супернатант	реакция высоко положительная
+++	75%	массивное, конгломераты распадаются при встряхивании пробирок	супернатант с лёгкой опалесценцией	реакция умеренно положительная
++	50%	умеренное, конгломераты распадаются при встряхивании пробирок	супернатант с выраженной опалесценцией	реакция положительная
+	менее 25%	конгломераты отсутствуют	мутная жидкость	реакция сомнительная
–	отсутствует	конгломераты отсутствуют	мутная жидкость, нет отличия от отрицательного контроля	реакция отрицательная

Серологические реакции могут быть качественными и количественными. Качественная реакция отвечает на вопрос, есть ли в исследуемом материале искомые антитела (искомый антиген), которые определяются по диагностическому компоненту реакции. Количественные серологические реакции позволяют не только обнаружить антитела (антигены) в исследуемом материале по известному диагностическому компоненту, но и определить их количество по специальному параметру – по титру антител (антигена).

Титр антител – это максимальное разведение исследуемого материала, дающее положительный результат серологической реакции (обычно ++, т.е. 50%-ное связывание антигена). Титр Ат (или Аг) выражается разведением исследуемого материала, например, 1:16, 1:250 и т. п. Для постановки количественной серологической реакции нужно провести разведение исследуемого материала (сыворотки крови обследуемого человека) с определённым заданным проколом реакции шагом (т. е. в определённое количество раз), поставить реакцию и провести учёт результатов. Пример такой реакции приведен на рис. 4.3.

Рисунок 4.3 Пример реакции агглютинации в пробирках (пробирочная РА): титр определяемых антител 1:64

Постановка качественной реакции агглютинации на стекле для антигенной идентификации чистой культуры бактерий

Н а предметное (рис. 4.4) стекло нанесите (шаг 1) каплю изотонического раствора хлорида натрия (отрицательный контроль), каплю антисыворотки О111:Н24 к антигенам E.coli. В каждую каплю внесите (шаг 2) каплю тестируемой чистой культуры бактерий. При положительной реакции появятся агглютинаты, видимые глазом. Зарисуйте результат.

Рисунок 4.4 Схема РА на стекле для идентификации чистой культуры бактерий

Постановка реакции пассивной гемагглютинации (РПГА) для определения титра антител (к вирусу кори) в сыворотке крови:

1. Устанавливаем в штатив ряд пробирок. Нумеруем пробирки.
2. Вносим в опытные пробирки по 100 мкл изотонического раствора хлорида натрия.
3. В пробирку 1 вносим 100 мкл исследуемой сыворотки крови. На этом этапе в пробирке 1 объём внесённых реагентов составляет 200 мкл, в других пробирках остаётся по 100 мкл изотонического раствора NaCl.
4.Перемешиваем содержимое пробирки 1 и переносим из неё в пробирку 2 100 мкл разведённой сыворотки крови. Эту операцию проводим с последующими пробирками. Из пробирки 7 удаляем 100 мкл реакционной смеси.
Во всех пробирках на этом этапе постановки реакции по 100 мкл разведенной изотоническим раствором NaCl сыворотки крови. Но в каждой пробирке другое разведение. Подпишите все полученные разведения сыворотки крови.
5. В пробирки вносим по 100 мкл эритроцитарного диагностикума. 6. Готовим контроли: положительный – 100 мкл эритроцитарного диагностикума + 100 мкл стандартной положительной сыворотки; отрицательный – 100 мкл эритроцитарного диагностикума + 100 мкл изотонического раствора NaCl. 7. Проводим инкубацию при + 37°С в течение 1 часа. 8. Результат учитываем по образованию агглютинатов.