2. Для предупреждения проникненя кислорода в среду его заливают слоем стерильного вазелинового масла или парафином.

3. Столбик питательной среды в пробирках должен быть достаточно высоким (10-12 см). Кислород, как правило,дифундирует в толщу столбика на глубину до 2 см, потому ниже создаются благоприятные условия для культивирования анаэробных микробов.

4. Эвакуационно заместительный метод заключается в использовании анаэростатов. Они представляют собой герметические металлические или пластмассовые банки, из которых можно выкачать кислород и заменить его инертным газом (гелий, азот, аргон). Допускается использование трехкомпонентной газовой смеси, которая состоит из 80 % азота, 10 % диоксиду углерода и 10 % водорода. Порой допустимым считается использование природного газа. Для поглощения кислорода, который остается в анаэростате, используют палладиевые катализаторы. С целью поглощения водяной пары используют хлорид кальция, силикагель и тому подобное, которые помещают на дно анаеростата.

Химические методы. 1. Использование веществ, способных поглощать кислород. С этой целью допустимым является применение щелочного раствора пирогаллола. При этом учитывают поглощающую активность вещества: на 100 мл емкости герметического сосуда, в котором находятся чашки Петри, используют 1 г пирогаллола и 10 мл 2,5 N раствора гидроксиданатрия.

Кислородосвязывающий эффект имеет также гидросульфит натрия (Na2S2O4). Для связывания кислорода в 1 л воздуха используют смесь, которая состоит из 100 мл свежего 20 % раствору Na2S2O4 и 16 мл 50 % гидроксида калия.

2. Применение веществ-редуцентов. Учитывая, что рост облигатно-анаэробных бактерий происходит в средах с низким уровнем окислительно восстановительного потенциала, к ним добавляются специальные восстановители: цистеин (0,03-0,0,5 %), тиогликолевую кислоту или тиогликолат натрия (0,01-0,02 %), сульфид натрия, аскорбиновую кислоту (0,1 %), разнообразные сахара.

Функции обновителей могут выполнять кусочки паренхиматозних органов животных (печенка, почки, сердце) или даже растений (картофель, другие корнеплоды).

Степень поглощения кислорода или степень возобновления среды измеряют или электрометрически или с помощью индикаторов (резазурин, нейтральный красный, феносафранин).

3. Использование специальных газогенерирующих систем, которые позволяют создать бескислородные условия вмикроанаеростатах, транспортных пластиковых пакетах и тому подобное. Одной из самых распространенных есть система “Gas Generating Box”. В ее состав входят химические генераторы водорода (борогидрит натрию) и углекислого газа (таблетки бикарбоната натрия и лимонной кислоты), а также палладиевый катализатор, который поглощает кислород.

Чашки с посевами помещаются в микроанаеростат, на дне которого находится слой палладиевого катализатору. Кончик пакета “Gas Generating Box” надрезают ножницами, и у него наливают 10-15 мл воды. Пакет располагают вмикроанаеростати. Через 15-20 мин в нем создаются анаэробные условия. Водород, который выделяется, взаимодействует с кислородом, образовывая воду, а углекислота продуцируется при взаимодействии бикарбоната натрия с лимонной кислотой.

 

 

Анаеростат

 

Биологические методы. 1. Метод Фортнера. Метод заключается в совместном культивировании на одной средеаэробних и анаэробных микроорганизмов. Сначала по диаметру чашки вырезают полоску агару шириной до 0,5-1,0 см. С одной стороны засевают исследуемый материал, что содержит анаэробные возбудители, а из другого – микробы, которые являются индикатором анаэробных условий (Serratia marcescens или “чудесная палочка”). Края чашки парафинируют или закрывают пластилином. Через некоторое время на поверхности среды вырастают колонии как аэробных, так и анаэробных микробов. При поглощении кислорода Serratia marcescens дает рост бледно-розовых или бесцветных колоний, а при нарушениях герметичности – ярко-красные. На другой половине чашки вырастают колонии анаэробных микробов.

2. Метод Хеннеля (“часовых стекол”). Он является своеобразной модификацией предыдущего. Материал, который содержит анаэробные возбудители, засевается на поверхность питательной среды диаметром 2-2,5 см. Сверху он покрывается “часовым стеклом”, заполненным слоем МПА и засеяным Serratia marcescens. Аеробни микробы, поглощая кислород, создают условия для благоприятного роста анаэробных возбудителей.

В высоко специализированных лабораториях пользуются специальной анаэробной техникой, которая включает использование питательных сред без кислорода с обновителями, выполнения посевов и пересеваний в атмосфере инертных газов, углекислоты и тому подобное.

За последние годы созданы стационарные анаэробные боксы, которые содержат все необходимое для создания анаэробных условий культивирования, включая термостаты. Как правило, такие камеры заполняются трикомпонентноюгазовой смесью. Бактериолог работает в камере, находясь внешне, применяя резиновые рукавицы, вмонтированные у нее. Такое оборудование имеет неопровержимые преимущества, которые заключаются в том, что полностью исключается контакт кислорода с исследуемым материалом.

 

Выделение и идентификация анаэробных микроорганизмов

 

Учитывая современное развитие микробиологической науки, выделять и идентифицировать культуры анаэробных микроорганизмов можно аналогично аеробним бактериям. Обязательным при этом есть соблюдение на всех этапах исследования условий анаэробиоза, используя для этого трикомпонентну газовую смесь (в определенном соотношении азот, водород и углекислый газ) или систему “Gas Generating Box”.

Однако возбудители столбняка, ботулизма, газовой анаэробной инфекции можно выделять и идентифицировать за другой схемой.

На первом этапе (И день исследования) изучают макроскопические особенности клинического материала, делают мазок и окрашивают его за методом Грама. После этого материал засевают на среду Китта-Тароцци и молоко. Предварительно среду регенерируют на кипящей водяной бане в течение 10-20 мин и охлаждают. Непосредственно после посева материала среду нагревают на водяной бане при 80°С в течение 20 мин для уничтожения вегетативных неспоровых форм микробов. Среды ставят в термостат и при температуре 37 °С культивируют 1-3 сутки.

На втором этапе изучают проявления роста микроорганизмов (помутнение, образование осадка и газа на среде Китта-тароцци, пептонизация молока). Поскольку среда Китта-тароцци сверху залита слоем вазелинового масла для предотвращения доступа кислорода, у него окунают пастеровскую пипетку, набирают жидкость, из которой готовят мазок, крася его за методом Грамма. Под микроскопом в мазке можно видеть большие граммположительные палочкоподобные бактерии. После этого проводят занял материалу за методами Вейнберга или Цейсслера для получения изолированных колоний.

За методом Вейнберга готовят несколько узких высоких пробирок (3-4) с растопленным и охлажденным до 42-45 °С сахарным м’ясо-пептонним агаром. Возможно использование среды Вильсон-блера. Материал из среды Китта-тароцци вносят в первую пробирку с помощью пастеровской пипетки и тщательным образом перемешивают, потом переносят в друге, а дальше – в третью. Для застудневания агара их быстро охлаждают под струей холодной водопроводной воды. За счет этого живые микробные клетки фиксируются в определенных участок агара. После застывания агара пробирки культивируют при оптимальной температуре в течение 1‑2 суток для образования изолированных колоний.

 

Колонии по Вейнбергу

 

Содержание каждой пробирки можно, кроме того, всосать в пастеровские пипетки или трубки Виньяль-Вейона, следя, чтобы не было пузырьков воздуха. Последние имеют длину возле 30 см и диаметр 0,5-0,6 см. Верхний конец их, который закрывается ватой, имеет перетяжку, а нижний вытянут в виде капилляра. После заполнения пипетки ее вытянутый конец запаивают и кладут в термостат для культивирования. Через 1-2 сутки в агаре вырастают колонии анаэробных бактерий. Для того, чтобы их изолировать, трубку надрезают напильником на определенном уровне, разламывают, колонию берут бактериальной петлей или иглой, переносят в соответствующую среду.

Для выделения изолированных колоний за методом Цейсслера материал из среды Китта-тароцци или молока наносят петлей или 1-2 капли пастеровской пипеткой на чашку Петри с сахарно-кровяным агаром и делают посев шпателем за методом Дригальского. Не стерилизуя шпатель, засевают вторую чашку, а затем и третью. Чашки переворачивают вверх дном, подписывают, ставят в анаеростат, в котором создают анаэробные условия, а затем – в термостат при температуре 37 °С на 2-3 сутки. На последней чашке вырастают изолированные колонии.

Третий этап исследования начинается с изучения морфологических особенностей колоний, которые выросли в чашках Петри или трубках Виньяль-вейона. Исследуются их форма, величина, цвет, характер краев, рельеф колонии, консистенция и тому подобное. Из колоний готовят мазки, красят их за методом Грама. После этого колонии отсевают в среду Китта-Тароцци для получения чистой культуры. Посевы инкубируют определенное время при оптимальной температуре.

На четвертом этапе обращают внимание на особенности роста чистой культуры возбудителей на соответствующих средах, проверяют ее на чистоту и проводят идентификацию. Идентифицируют выделенные чистые культуры анаэробных микроорганизмов подобно аеробних за морфологическими, культуральными, биохимическими и биологическими признаками. Обязательно используют определение токсигенних свойств возбудителей в биологичниий пробе и реакции нейтрализации на лабораторных животных. В некоторых случаях определяют антигенные свойства микроорганизмов.

Таким образом, на основании изучения разнообразных свойств микроорганизмов делается вывод о принадлежности их к тому или другому виду.

Среды для культивирования анаэробных микроорганизмов

Среду Китта-Тароцци готовят на основе бульйона Хоттингера, к которому добавляют кусочки бычьей печенки илимяса. Стерилизуют его при 1 атмосфере в течение 30  мин. Активная реакция среды – 7,4-7,6. После посева материала среду заливают сверху слоем вазелинового масла толщиной до 1 см.

Анаэробный кровяной агар готовят на основе еритрит-агара. В его состав входят также специальные добавки: среда 199 (10 %), гемин (10 мкг/мл), твин-80 (0,1 %), метадион (10 мкг/мл), цитратна кровь (до 5 %) и тому подобное. После стерилизации его разливают в чашки Петри. Используют не позже, как через 2 год после изготовления.

Желтковый агар. В растопленную и охлажденную до 56-60 °С среду на основе еритрит-агара добавляют суспензию куриного желтка (20 %), глюкозу (0,2 %), гемин (10 мкг/мл) и разливают в чашки Петри. Среду используют для определениялецитиназнои активности возбудителей, в частности C. perfringens. При наличии лецитиназы вокруг колоний образуются зоны помутнения.

Коммерческая среда для контроля стерильности. Его можно использовать в качестве транспортное. Для улучшения роста анаэробных бактерий к его составу можно вводить специальные добавки, такие как среда 199, гемин, твин-80,метадион, цитратна кровь и тому подобное.

Среда Вильсон-блера. Его готовят на основе растопленного и охлажденного до 60 °С 1 % сахарного (глюкоза) МПА рН7,4 с добавлением на 100 мл 10 мл стерильного 20 % раствору сульфита натрия и 1 мл 8 % раствору хлорида железа. Готовую среду не стерилизуют.

Его используют для ускоренной диагностики газовой анаэробной инфекции, вызванной Clostridium рerfringens. Уже через 1-2 год наблюдают изменение среды: оно чернеет в результате возобновления сульфита натрия в сульфат, который взаимодействует с хлоридом железа, образовывая сульфид железа. Появляются также разрывы агара в результате интенсивного газообразования.

Лакмусовое молоко. Готовят среду из свежего молока. Предварительно его кипятят и оставляют в прохладном месте на одни сутки. Снимают верхний слой жира и процедуру повторяют. Молоко фильтруют, и 10 % раствором бикарбоната натрия доводят рН до 7,2. Перед стерилизацией к молоку добавляют 5-10 % лакмусовой настойки и идентичное количество 10 % раствору бикарбоната натрия, чтобы пена молока приобрела сине-фиолетовый оттенок. При пидлужуванни молока оно становится сине-фиолетовым, при пидкислюванни – розовым вплоть до красного.