9. Приготовление препаратов для изучения микроорганизмов в нативном виде: методы "висячей", "раздавленной" капли и витальная (прижизненная) окраска.

Приготовление препарата для изучения микроорганизмов в нативном виде

Метод "висячей капли". Препарат готовят на покровном стекле, в центре которого наносят одну каплю бактериальной культуры. Затем предметное стекло с лункой, края которой предварительно смазывают вазелином, прижимают к покровному стеклу так, чтобы капля находилась в центре лунки. Быстрым движением переворачивают препарат покровным стеклом вверх. В правильно приготовленном препарате капля должна свободно висеть над лункой, не касаясь ее дна или края. Для микроскопии вначале используют малый сухой объектив 8Х, под увеличением которого находят край капли, а затем устанавливают объектив 40Х и исследуют препарат.

Метод "раздавленной" капли. На поверхность обезжиренного предметного стекла наносят каплю исследуемого материала или суспензию бактерий и покрывают ее покровным стеклом. Капля должна быть небольшой, не выходящей за край покровного стекла. Микроскопируют препарат с объективом 40Х. После микроскопии препараты "раздавленной" капли или "висячей" капли опускают в дезинфицирующий раствор.

10. Порядок Spirochaetalis, их морфологические особенности. Внутривидовая дифференциация по морфологическим особенностям.

Спирохеты (speira – виток, изгиб, chaite – волосы) представляют собой спирально извитые подвижные микроорганизмы, объединённые в порядок Spirochaetales. Среди спирохет имеются свободноживущие формы, комменсалы – представители нормальной микрофлоры человека и паразитические формы.

Патогенностью обладают спирохеты из родов Treponema (сифилис), Borellia (эпидемический и клещевой возвратный тиф), Leptospira (лептоспироз). Спирохеты имеют форму длинных тонких спирально извитых клеток. Форма и количество завитков характерны для каждого рода спирохет. В неблагоприятных условиях некоторые спирохеты могут переходить в форму цисты. Обладают способностью к активному движению – в клеточной стенке содержатся упорядоченно расположенные микрофибриллы - эндофлагеллы (прикреплены к блефаропластам – базальным тельцам). Клетка спирохеты в структурном отношении представляет собой цитоплазматический цилиндр, ограниченный ЦПМ и покрытый клеточной стенкой. В цитоплазме содержатся нуклеоид, рибосомы, мезосомы, включения. Клеточная стенка тонкая, состоит из наружной мембраны и пептидогликанового слоя, тесно прилежащего к ЦПМ. У ряда спирохет (трепонема) имеется наружный слизистый слой, имеющий вид чехла, окружающего клетку.

Морфологию спирохет изучают в световом микроскопе в окрашенных препаратах, в живом состоянии в фазово-контрастном или темнопольном микроскопе. Спирохеты различаются по способности окрашиваться: одни хорошо окрашиваются обычными анилиновыми красителями - фуксином (боррелии – грамотрицательные), другие требуют специальных методов окраски (чаще всего по Романовскому-Гимзе).

11. Морфологические особенности риккетсий, хламидий, микоплазм их систематика, классификация. Морфология вегетативной и покоящейся стадий.

Морфология риккетсий и хламидий. Риккетсии и хламидии входят в отдел Gracilicutes и составляют соответственно роды Rickettsia,Chlamidia и Chlamydophila. Они являются энергетическими облигатными внутриклеточными паразитами. У них отсутствует система регенерации АТФ. Они поражают членистоногих, птиц, животных и человека. Их не культивируют на искусственных питательных средах. Они размножаются: в желточном мешке куриного эмбриона, в организме экспериментальных животных, в тканевых культурах.

Риккетсии названы в честь американского ученого Риккетса, который описал возбудителя риккетсиоза. Имеют все структуры, присущие прокариотам: клеточную стенку (в ней содержится мурамовая кислота), нуклеоид, рибосомы. Спор, жгутиков, капсул не имеют.

Грамотрицательны, окрашиваются по Романовскому-Гимзе в лиловый цвет, по Здродовскому (аналог метода Циль-Нильсена) – в красный. Риккетсии полиморфны, т. е. имеют различные морфологические формы: кокковидные (0,5 мкм); палочковидные (1,5 мкм); бациллярные (2-4 мкм); нитевидные (10-40 мкм).

Размножаются риккетсии простым делением, а нитевидные формы – дроблением. Вызывают сыпной тиф идругие риккетсиозы.

Хламидии (сhlamydis – плащ). Хламидии выделены в отдельный порядок Chlamydiales, который включает 4 семейства. Ведущие патогенные для человека представители хламидий сосредоточены в семействах Chlamydiaceae и Parachlamydiaceae, включающие, соответственно, роды Chlamydia и Chlamydophila. Основными, наиболее важными в патологии человека представителями этих родов являются C. psittaci, C. pneumoniae, C. trachomatis.

Хламидии грамотрицательные, очень мелкие (0,5 мкм), сферической формы микроорганизмы с облигатным внутриклеточным паразитизмом. Спор, капсул, жгутиков не образуют. Биологическое своеобразие хламидий состоит в энергозависимом паразитизме и уникальном цикле развития. Имеются 2 стадии жизненного цикла. Одна – инфекционная стадия – элементарные тельца (ЭТ), она приспособлена к внеклеточному существованию; другая – ретикулярные тельца (РТ) – внутриклеточная неинфекционная форма, лабильна, обладает выраженной метаболической активностью.

Элементарные тельца имеют размер 0,3 мкм, содержат нуклеоид, в клеточной стенке имеется слой – аналог пептидогликана грамотрицательных бактерий. ЭТ проникают в клетку при фагоцитозе. Из поверхностных мембран клетки хозяина вокруг ЭТ образуется вакуоль и ЭТ превращаются в крупные ретикулярные тельца (диаметр 0,5-1 мкм). Внутри образованной вакуоли РТ многократно делятся. В конечном счете вакуоль через 8-12 циклов деления заполняется этими частицами и превращается в микроколонию (включение). На последней генерации из РТ образуются ЭТ нового поколения. Затем мембрана, которая окружает микроколонию, разрушается, и хламидии выходят в цитоплазму, а далее за пределы клетки. Диагностическое значение имеет обнаружение цитоплазматических включений РТ или мелких ЭТ, которые отличаются от ядра клетки и цитоплазмы по цвету и внутренней структуре. Хламидии вызывают трахому, орнитоз, венерический лимфогранулематоз, бленнорею с включениями.

МОРФОЛОГИЯ РИККЕТСИЙ. Риккетсии занимают промежуточное положение между бактериями и вирусами. Представляют собой грам- прокариоты, мелкие, размеры не превышают 1,5 мкм. Как правило, они не способны расти на искусственных питательных средах, т.е. являются облигатными паразитами (в организме глистоногих). Отличаются выраженным полиморфизмом, образуя кокковидные, палочковидные, нитевидные формы. Располагаться могут одиночно, по двое, или в виде коротких цепочек. Электронно-микроскопические исследования показали, что риккетсии не имеют жгутиков, не образуют спор и капсул. Исключение: у риккетсии Провачека отмечается наличие наружного слизеподобного слоя, сходного с бактериальной капсулой. По своей ультраструктуре риккетсии сходны с грам- бактериями. Их клетки содержат клеточную стенку, ЦПМ, цитоплазму, в которой находятся нуклеоид, рибосомы и лизосомы. Большинство риккетсии обитает в организме членистоногих. Некоторые виды патогенны для человека и животных и вызывают заболевания, называемые риккетсиозами (например, риккетсии Провачека вызывают сыпной тиф, риккетсии конозии - марсельскую лихорадку и т.д.) Морфологию риккетсии изучают в световом микроскопе в препаратах, окрашенных по методу Романовского - Гимзе по способу Здродовского или Хименеса, а также в фазово-контрастном микроскопе. МОРФОЛОГИЯ ХЛАМИДИИ. Хламидии или гальпровии относятся к облигатным внутриклеточным кокковидным грам- бактериям. Геном хламидии содержит в 4 раза меньше генетической информации, чем геном кишечной палочки. Хламидии размножаются только в живых клетках: их рассматривают как энергетических паразитов. По - видимому, у хламидии отсутствует система регенерации АТФ. Вне клеток (хозяина) хламидии имеют сферическую форму (О,3мкм), являясь элементарными тельцами. Внутри клеток они превращаются в делящиеся ретикулярные тельца, образуются их скопления - включения. Подобно бактериям хламидии имеют клеточную стенку с пептидоглюканами, рибосомы, РНК и ДНК, большое количество ферментов (ферментируют глюкозу с образованием СО2), нуклеоид. Размножаются они как и бактерии путём поперечного деления. Новобразованные мелкие частицы могут выходить из клетки хозяина и инфицировать новые клетки. Цикл развития занимает 24-48 часов. Хламидии, подобно риккетсиям, обладают свойством особым образом воспринимать окраску; Эта способность меняется на разных стадиях развития. Одиночные зрелые частицы («элементарные тельца») по Романовскому-Гимзе окрашиваются в пурпурный цвет, который хорошо контрастирует с синим цветом цитоплазмы клеток хозяина. Крупные неинфекционные тельца (первоначальные тельца) окрашиваются по Романовскому - Гимзе в синий цвет. Окраска по Граму даёт отрицательные или вариабельные результаты, поэтому данный метод не имеет ценности при идентификации возбудителей. У человека хламидии вызывают трахому, орнитоз и др. МОРФОЛОГИЯ МИКОПЛАЗМ. Микоплазмы отнесены в царство Procaryotes, класс Mollicutes (мягкокожие), пор. Mycoplasmatales, семейство Mycoplasmataceae, объединяющее 2 рода l)Mycoplasma (35 видов) и 2)Ureaplasma urealyficum и семейство Acholeplasmataceae и род Achooleplasma (5 видов).  Микоплазмы имеют строение прокариотов, но у них отсутствует клеточная стенка. Это - мелкие бактерии, окружённые цитоплазматической мембраной. Этим объясняется их полиморфизм. Из-за отсутствия клеточной стенки микоплазмы осмотически чувствительны и имеют разнообразную форму: кокковидную, нитевидную, колбовидную, гранул в виде крошечных кокков и элементарных телец, крупных шаров, колец, палочек, ветвящиеся или мицелиапьные формы и др. Эти формы видны при фазово-контрастной микроскопии чистых культур микоплазм. Размеры микоплазм варьируют от 125-250нм у гранулярных форм до 0,4-150мкм у нитевидных структур. Жгутиков, капсул, спор не образуют. По Граму окрашиваются отрицательно. В световом микроскопе обнаруживаются лишь самые большие формы микоплазм. В живом состоянии их изучают в тёмном поле и фазово-контрастном микроскопе, ультраструктурные элементы выявляют при помощи электронной микроскопии. Патогенные микоплазмы вызывают хронические инфекции. M.pneumoniae вызывают у человека заболевания по типу острой респираторной инфекции. Микоплазмы вызывают заболевания и у животных, и у растений. Достаточно широко распространены и непатогенные микоплазмы (в почве, в воде, на гниющих субстратах). Жизненный цикл риккетсий имеет две стадии — вегетативную и покоящуюся. В вегетативной стадии микроорганизмы представлены палочковидными, бинарно делящимися и подвижными клетками.

Покоящиеся формы риккетсий — сферические и неподвижные клетки, располагающиеся в клетках членистоногих и теплокровных.

Репродукция, за исключением одного вида, происходит только в живых клетках, то есть, как и вирусы, риккетсии являются облигатными внутриклеточными паразитами, рост и размножение которых происходят в клетках подходящего хозяина. Паразитируют в цитоплазме и ядре или только в цитоплазме клеток членистоногих и теплокровных животных. Лишь один вид риккетсий (Rochalimaea quintana), вызывающий окопную лихорадку, может расти вне клеток в кишечнике вши, а также в бесклеточной питательной среде. В жизненном цикле большинства риккетсий членистоногие являются первичными хозяевами или переносчиками.