2. Методи дослідження мембранних структур
А) Дифракція рентгенівських променів
Дифракція рентгенівських променів – метод вивчення атомної і молекулярної структури кристалічних речовин з використанням рентгенівських променів. Рентгенівські промені направляють на такі речовини і вивчають їхній розподіл після проходження (розсіювання) через кристал, обумовлене дифракцією променів на атомах, внаслідок чого з'являються дифраговані пучки – результат інтерференції вторинного рентгенівського випромінювання, що виникає при взаємодії первинного випромінювання з електронними оболонками атомів.
Цей метод дозволяє з високою роздільною здатністю отримувати інформацію про структуру кристалічних речовин. У випадку малоупорядкованих препаратів можливості цього методу обмежені. Деякі спеціалізовані мембранні системи мають регулярну структуру, тому їх можна вивчати рентгеноструктурними методами. Найбільш поширеним таким прикладом є мієлінова оболонка, яка, багаторазово обертаючись навколо аксона, формує регулярну систему з концентричних мембранних структур. Цей метод можна застосовувати і для вивчення штучно створених систем, які утворюються при колапсуванні в умовах центрифугування мембранних везикул, отриманих з мітохондрій та еритроцитів. Хоча рентгеноструктурні дані дозволяють отримати деяку інформацію про те, як розташована в мембрані більшість мембранних білків (інтегральних або периферийних), в цілому метод рентгеноструктурного аналізу не дає детальної молекулярної картини.
Б) Електронна мікроскопія
Просвічуюча електронна мікроскопія тонких зрізів мієліну, як і багатьох інших мембранних структур, виявляє характерну картину, що складається з двох електроногустих смуг, розділених проміжком близько 80 Å. Така картина виходить у результаті обробки мембранних препаратів чотириокисом осмію, який, зазвичай, застосовується у цьому методі. Однак у цьому методі є істотний артефакт – при приготуванні препаратів для аналізу мембрани піддаються несприятливих впливам. Обробка чотириокисом осмію призводить до значної втрати білка з еритроцитарної мембрани. І хоча тришарова структура, яка при цьому спостерігається, до певної міри відображає організацію бішарової мембрани, більш детальні відомості щодо локалізації білків у мембрані цим методом отримати не вдається.
Деяку інформацію про розташування мембранних білків дали нові електронно-мікроскопічні методи, які стали тепер вже класичними, – методи заморожування-сколювання і заморожування-травлення (сублімація). У цьому випадку препарати швидко заморожують, не піддаючи їх ушкоджуючій дій. Процес підготовки препарату включає наступні операції (рис. 5.1):
1. Після заморожування зразок, який представляє собою суспензію клітин або мембран, сколюють за допомогою ножа при низькій температурі (-100°С) у глибокому вакуумі. При цьому мембрана розколюється по своїй серединній області та розщеплюється на дві половинки. У результаті на утворених площинах відколу оголюється внутрішня область мембрани.
2. За необхідності зразок піддають травленню – проводять звичайну сублімацію льоду в вакуумі. Це дозволяє краще віазулювати поверхневі структури клітинних мембран.
3. Після цього отримують так звану репліку з оголеною поверхнею (саме цю репліку і досліджують під електронним мікроскопом). Для отримання репліки спочатку напилюють на зразок платину під кутом близько 45о, щоб виявити топологічні характеристики препарату. Потім платиновій репліці надають механічної міцності, напиливши на неї шар вуглецю. Після цього препарат відтаюють, репліка спливає і піддається аналізу.
Рис 5.1. Дослідження мембран методом заморожування-сколювання. А – площина відколу замороженої клітини частково проходить через центральну частину різних мембран. Б – роз'єднання двох половинок. В – зразок піддають сублімації для виявлення деталей поверхні шару. Г – на зразок напилюють шар платини, а потім шар вуглецю, отримуючи репліку з поверхні зразка. Д – отриману репліку відокремлюють від препарату і досліджують під електронним мікроскопом.
Найбільш характерні структури, що спостерігаються при вивченні мембран методом заморожування-сколювання, – це численні внутрішньомембранні частинки діаметром від 80 до 100 Å, які лежать в площині мембранних сколів. Зазвичай вони розташовані хаотично, але іноді утворюють групи. Найімовірніше, ці частинки є мембранними білками. При електронній мікроскопії тонких зрізів подібні структури не виявляються. Репліки, отримані від двох половинок розщепленої мембрани, не завжди топологічно комплементарні. Це означає, що деякі частинки зв'язані тільки з однією з половин мембрани.