3. Методи вивчення динамічного поведінки мембранних систем і ліпід-білкових взаємодій
Усі біологічні структури за своєю природою динамічні, і при розгляді їхніх функцій необхідно враховувати рухливість компонентів, з яких ці структури складаються.
Що криється за поняттям «динамічні властивості мембран»? Поперечна асиметрія в розподілі ліпідів, а, можливо, і пасивна дифузія через бішар певним чином пов'язані зі швидкістю трансмембранного фліп-флоп переходу ліпідів. Швидкість ферментативних реакцій, що протікають за участю мембранозв'язаних компонентів, залежить від швидкості латеральної дифузії компонентів мембран. І, нарешті, ліпідно-білкові взаємодії залежать від швидкості, з якою відбувається обмін ліпідами між найближчим оточенням білків йіншим об'єктами мембрани.
Вивчаючи процеси, що протікають в мембранних структурах, необхідно представляти їх тимчасові характеристики одночасно і тимчасову роздільну здатність методів, які використовують для аналізу.
Для прикладу на рис. 5.2 наведено зіставлення деяких хімічних і фізичних реакцій у біологічних мембранах з діапазоном швидкостей, доступних для вимірювання за допомогою розповсюджених методів.
Рис. 5.2. Порівняння характерних частот рухів мембранних білків і ліпідів з діапазоном чутливості різних спектроскопічних методів. Діапазон чутливості методів вказаний приблизно.
Часовий діапазон різних форм рухливості, зафіксованих в мембрані, вельми широкий: від молекулярних коливань з частотою 1014 с-1 до трансмембранного фліп-флоп переходу ліпідів, характерний час якого може досягати декількох годин. Одні методи дозволяють отримати статичну картину мембрани, оскільки характерний час відповідних рухів більший, ніж час вимірювання, а інші методи дають усереднену за часом картину, оскільки час переміщення молекул набагато менший, ніж час вимірювання.
Розглянемо два основних типи експериментів.
Перші грунтуються на використанні внутрішньо-мембранних зондів для вивчення мікров'язкості мембрани. Індикаторами фізичного стану мембрани, а також характеру ліпідно-білкових взаємодій можуть служити низькомолекулярні ЕПР-мітки і флуоресцентні зонди.
Другий тип експериментів спрямований на пряме вимірювання латеральної дифузії мембранних білків або ліпідів і обертальної рухливості білків усередині бішару.
А) Мікров'язкість мембран і застосування мембранних зондів
Для звичайної рідини, якою є, наприклад, вода, текучість визначається як величина, обернена в'язкості. В'язкість характеризує тертя, що виникає між сусідніми шарами рідини, які рухаються з різними швидкостями. В'язкість рідини можна оцінити, вимірявши швидкість, з якої падає мармуровий кулька в рідкому середовищі. У разі мембран термін «плинність» зазвичай носить якісний характер: мається на увазі опір, якого надає мембрана різним типам переміщень в ній.
В’язкість відіграє важливу фізіологічну роль при адаптації різних організмів до зовнішніх впливів. Подібні явища спостерігаються найчастіше при вивченні термічного стресу, коли мікроорганізми, рослини, пойкілотермні або зимуючі тварини піддаються впливу низьких температур. Адаптація полягає в зміні ліпідного складу мембран, а саме у збільшенні вмісту ненасичених ліпідів або зменшенні середньої довжини ацильного ланцюга. Подібні зміни ведуть до зменшення щільності упаковки ліпідів у мембрані і таким чином підтримують мікров'язкість мембран на необхідному рівні.
Зазвичай мембрани знаходяться у рідкокристалічному стані. При переході мембрани з рідкокристалічної фази у фазу гелю (більш твердий стан) мікров'язкість збільшується. Структурні та функціональні властивості бішару, який знаходиться у фазі гелю, несумісні з організацією і успішним функціонуванням білкових компонентів у мембрані. При переході мембрани з рідкокристалічної фази у фазу гелю мікров’язкість збільшується приблизно на два порядки. Як правило, для вимірювання плинності вимірюють молекулярну рухливість спінових або флуоресцентних зондів, включених у мембрану. Зондами, зазвичай, є невеликі молекули, які можна порівняти з розмірами мембранних фосфоліпідів.
Ліпідний бішар не є просто в'язкою тривимірною рідинно-кристалічною структурою, а являє собою рідке середовище з низькою в'язкістю, у якої склад і динамічні властивості в центральній області сильно відрізняються від складу і властивостей периферійних полярних ділянок. Обертальна рухливість молекули зонда в мембрані не ізотропна, а до певної міри обмежена. Часто зонди всередині мембрани мають переважну орієнтацію та їхні рухи обмежені певними рамками. Локалізація різних зондів у мембрані залежить від їх природи, тому, підбираючи зонди різної структури, можна отримувати інформацію від різних ділянок мембран. Чим більш щільніша упаковка характерна для мембрани, тим суттєвіше обмежується рухливість зонда.
Розглянемо 3 методи: електронний парамагнітний резонанс (ЕПР), метод деполяризації флуоресценції, які дозволяють вимірювати як швидкість руху зонда, так і опір цьому руху, і метод ядерного магнітного резонансу (ЯМР).
Необхідно мати уявлення про те, що саме вимірюється за допомогою мембранних зондів. Розглянемо загальний випадок, який застосуємо до ЕПР, вимірювання флуоресценції або 2Н-ЯМР. Всі три спектроскопічні методи чутливі до орієнтації молекул зондів. Спектр 2Н-ЯМР чутливий до орієнтації зв'язку С-D (вуглець-дейтерій) щодо прикладеного поля. Градієнт локального поля, векторно підсумовуючись із зовнішнім полем, дає результуючу, яка і вловлюється дейтерієм. Аналогічна ситуація характерна і для ЕПР. Спектр ЕПР залежить від орієнтації нітроксильного зв'язку N-О, який містять більшість використовуваних зондів, щодо прикладеного магнітного поля. У разі флуоресцентної спектроскопії вимірювана поляризація світла, що випускається, залежить від орієнтації дипольного моменту переходу щодо напрямку, що визначається використовуваним поляризатором.
Б) Електронний парамагнітний резонанс (ЕПР)
Принцип парамагнітного резонансу був відкритий в 1944 році проф. Є.К. Завойським. Як метод дослідження рухливості (впорядкованості) макроструктур він став застосовуватися лише після розробки способу створення стабільних парамагнітних сполук, що містять нітроксильний радикал.
Неспарений електрон атома азоту стабільного парамагнітного з'єднання (спінового зонда або спінової мітки – різниця між ними в тому, що молекули першого типу вільно плавають у мембрані, а другого – ковалентно зв'язані з її компонентами) при накладенні сильного магнітного поля переходить з одного енергетичного рівня на інший під дією мікрохвильового випромінювання (близько 1010 Гц). Метод досить чутливий: спектр зонда може бути зареєстрований при концентрації спінових міток близько 10-6 М. Спектр ЕПР представляють у вигляді першої похідної від спектру поглинання.
У спектрі нітроксильного радикала є три піки, які відповідють спін-спіновим взаємодіям неспареного електрона і ядра атома азоту. Як вже було зазначено, спектр ЕПР залежить від орієнтації молекули – спінової мітки або спінового зонда, які містять нітроксильний радикал, щодо прикладеного магнітного поля.
Рухливість, яка описується цим методом, характеризується так званим часом обертальної кореляції, який знаходиться в межах 10-8-10-10 сек (від декількох нсек до 0,1 нсек) для вільного обертання мітки. Приклади ЕПР спектрів наведені на рис. 5.3.
Рис. 5.3. Залежність ЕПР-спектрів нітроксильної спінової мітки від швидкості молекулярного обертання. Спектри отримані при різних температурах і, отже, при різній в'язкості середовища.
Характер спектра залежить від характеру обертання молекули. На рисунку наведено спектри для різних випадків – від вільного обертання до повної загальмованості. Метод ЕПР-спектроскопії має певні обмеження. Високі концентрації спінових зондів модифікують бішар, а ковалентні мітки, зв'язуючись з білками, можуть інактивувати їх. У результаті дослідник вивчає мембрану не в нативному стані, а в тому вигляді, який вона приймає після модифікації. Крім того, треба мати на увазі, що швидкості процесів, які описуються за допомогою методу ЕПР, набагато більші за ті, які лежать в основі функціонування мембранних ферментів.
В) Деполяризація флуоресценції
Для вимірювання обертальної дифузії молекул давно використується метод деполяризації флуоресценції. Обертання деяких зондів у мембранах часто порівнюють з їх обертанням в оліях з відомою в'язкістю, при цьому користуються поняттям «мікров'язкість». Суть методу полягає в тому, що зразок опромінюють поляризованим світлом, який буде переважно порушувати ті молекули, які мають таку ж орієнтацію дипольного моменту. Світло, що випускається, аналізують за допомогою поляризаторів. Мікров'язкість бішару дуже висока (відповідає величинам 1-10 пуаз, 1 Пуаз = грам/(см c), 1 Пуаз = 0.1 Па с.), тому час обертальної кореляції невеликих флуоресцентних і ЕПР-зондів становить 10-8-10-9 сек. У воді, що має в'язкість 0,01 пуаз, молекули такого розміру оберталися б принаймні в 100 разів швидше. Методи ЕПР і деполяризації флуоресценції реєструють швидкі процеси, які здійснюються за час порядку 10-8 с, а інформація про більш повільні рухах вислизає від спостереження.
Мембранні білки мають значно більші розміри, ніж згадані мітки, і тому обертаються набагато повільніше. Щоб мітки, пришиті до цих білків, були чутливі до обертання білків, їх час життя у збудженому стані має становити 10-3 с. Отже, методи, що застосовуються для вивчення обертання білків у бішарі, повинні бути здатними реєструвати час кореляції від 10-5 до 10-3 сек. Метод деполяризації флуоресценції у цьому випадку непридатний, оскільки час життя молекул у збудженому стані становить близько 10-8 сек, і в такому тимчасовому масштабі молекули білків представляються нерухомими. Тому використовуються певні модифікації методу.
1) До досліджуваного білка приєднують зонд, час життя якого в збудженому триплетном стані досить великий. Якщо мітка жорстко зв'язана з білком, то для реєстрації обертання білка можна використовувати вимірювання анізотропії фосфоресценції. Для таких вимірювань виявилися придатними похідні еозину, оскільки час життя еозину в триплетном стані складає приблизно 2 мс.
2) Інший випадок, коли самі молекули білка містять групи, що переходять при флеш-фотолізі в довгоживучий збуджений стан, параметри якого можна оцінити за допомогою дихроїзму поглинання. Як приклад можна навести родопсин і бактеріородопсин, де використовуються збуджений стан зв'язаного ретиналя і збуджені стани, які спостерігаються при фотолізі комплексів цитохром-СО з використанням цитохром с оксидази і цитохрому Р450. Вимірювання можна проводити in situ (наприклад, у складі мітохондріальних мембран) або з очищеним білком, вбудованим у фосфоліпідні везикули.
3) За допомогою звичайної ЕПР-спектроскопії не вдається реєструвати обертання, характерна частота яких дорівнює частоті обертання мембранних білків. Для цих цілей розроблено спеціальний метод – ЕПР з переносом насичення, діапазон чутливості якого дуже широкий – від 10-7 до 10-3 с. Цей метод застосовувався при вивченні обертання декількох мембранних білків з ковалентно пришитими до них спіновими мітками.
Г) Ядерно-магнітний резонанс (ЯМР)
В основі ЯМР-спектроскопії лежить поглинання електромагнітних хвиль у радіочастотному діапазоні ядрами, які мають магнітний момент. Найбільш часто в дослідженнях використовуються ядра13С, 2Н, 31Р. Детальну картину будови гідрофобної області ліпідного бішару вдалося отримати за допомогою методу 2Н-ЯМР. Атоми водню в певних місцях ліпідної молекули можна вибірково замінити дейтерієм. Це м'який спосіб зондування мембран. Вважається, що він, як правило, не вносить збурень в їхню структуру. Спектри деяких дейтерованих диміристоїлфосфатидилхолінів представлені на рис. 5.4.
Рис 5.4. Спектри 2Н-ЯМР диміристоїлфофатидилхоліну, дейтерованого за різними положеннями ацильної ланцюга. Цифри зліва позначають положення двох (чи трьох) атомів дейтерію в кожному ланцюзі. Спектр зразка з дейтерованою кінцевою метильною групою набагато вужчий всіх решти наведених спектрів, що вказує на значну неупорядкованість центральної області бішару.
Піки ЯМР лежать у радіочастотному діапазоні, а відмінності в частотах сигналів для різних ізотопів набагато перевищують ширину сигналу поглинання. Спектри ЯМР малих молекул добре роздільні. Так, спектр ЯМР молекули холестеролу дозволяє ідентифікувати резонанс кожного атома окремо і отримати інформацію про рухливості різних ділянок молекули в залежності від її оточення. Метод ЯМР дозволяє з високою вибірковістю отримати відомості про поведінку різних частин молекули.
При переході до більш великих молекул спектри ЯМР сильно ускладнюються і часто стають нероздільно-здатними. Іншим недоліком ЯМР-спектроскопії є досить низька чутливість – концентрація зразка повинна бути не менше 10-3 М (що досить багато), в той час, як оптичні методи дозволяють отримати інформацію про молекули, концентрація яких становить 10-6-10-7 М.
Д) Метод кругового дихроїзму
Метод кругового дихроїзму дозволяє з'ясувати, який тип вторинної структури переважає у мембранних білках. Величина кругового дихроїзму, яка характеризується зазвичай еліптичністю, являє собою різницю в поглинанні зразком право- і лівополяризованого світла. Вона пояснюється відмінностями в коефіцієнтах молярної екстинкції право-і лівополяризованого по колу світла.
На перший погляд видається, що частка спіральних ділянок в молекулі білка – не найінформативніший параметр. Але за допомогою цього методу можна з'ясувати, чи здійснюється прямий вплив на мембранні структури зовнішніх факторів, якщо цей вплив змінює спіралізацію білкових молекул. Ця зміна часто має місце в тих випадках, коли спостерігається власний конформаційний зсув у молекулі білка або є взаємодія молекул білка один з одною, що змінює їх конформацію.
Е) Метод скануючої калориметрії
Принцип методу диференційної скануючої калориметрії полягає у вимірюванні тепла, необхідного для збільшення температури об'єкта на дуже малу величину при безперервному підвищенні температури об'єкта. При роботі з ліпідами мембран зміна їх фазового стану також може супроводжуватися поглинанням або виділенням тепла. Чим вище значення поглиненого тепла, тим більш значна молекулярна реорганізація відбувається в зразку за цих умов. Таким чином, зміну конформації макромолекул можна вимірювати, реєструючи тепло, що виділяється або поглинається при конформаційних переходах.
Чому метод називається диференційним? Тому що для знаходження теплоти фазового стану речовини необхідно з реєстрованого поглинання (або виділення) системою тепла вирахувати тепло, що поглинається (або виділяється) нею за відсутності фазових переходів, – власну теплоємність.
Сучасні чутливі калориметри дозволяють вимірювати фазові переходи у водно-ліпідних дисперсіях. Застосування цього методу для дослідження простих штучних систем дало цінну інформацію про принципи організації бішару.
Для нативних мембран цінність методу диференційної скануючої калориметрії нижча, ніж для штучних систем. Високий вміст холестеролу в плазматичних мембранах не дозволяє виявити виразних змін теплопродукції в області фазових переходів. У разі внутрішньоклітинних мембран фазові переходи не виявляються з іншої причини: ці мембрани виявляються досить «рідкими» в прийнятному інтервалі температур (5-60ºС).
Є) Флуоресцентна спектроскопія
Світлова хвиля, стикаючись з молекулою якої-небудь речовини, або розсіюється (змінює напрямок руху), або поглинається (передає свою енергію молекулі). При цьому молекула переходить у збуджений стан. Енергія, поглинена молекулою, може розсіятися у вигляді тепла (в результаті зіткнення з іншими молекулами) або випромінюватись у вигляді світла. Яка саме подія із зазначених тут матиме місце, визначається станом молекули в момент зіткнення. Збуджені електрони повертаються на основний рівень двома шляхами: або випромінюючи світло, або за допомогою безвипромінюючого переходу. У першому випадку світло, яке випускається, має меншу енергію і більшу довжину хвилі (так званий Стоксовий зсув), оскільки частина енергії втрачається.
Ефективність флуоресценції (ймовірність випромінювального переходу) визначають і внутрішні, і зовнішні фактори. До числа зовнішніх факторів відноситься зіткнення з молекулою гасителів (динамічне гасіння) або утворення комплексу флуоресцентної молекули з гасителем (статичне гасіння).
Перший процес (випромінювальний перехід) залежить від в'язкості середовища і може бути використаний для її вимірювання. Гасителями флуоресценції є важкі аніони або катіони (J, Br, Cs+, Cu2+), парамагнетики (Мn2+, нітроксильні радикали). Крім того, спостерігається гасіння флуоресценції в полярних розчинниках, наприклад, у воді.
Другий випадок – безвипромінювальний перехід в основний стан – відбувається, якщо найбільш високий коливальний підрівень основного стану має приблизно ту ж енергію, що і низький коливальний рівень збудженого стану. Такий перехід характерний для «гнучких» молекул. У «жорстких» молекул, які містять ароматичні кільця, найчастіше спостерігається випромінювання частини поглиненої енергії. Перехід молекули в збуджений стан супроводжується зміною дипольного моменту молекули. Це, в свою чергу, поляризує електронні оболонки оточуючих молекул, що призводить до зміщення атомів і переорієнтації молекул. Витрата енергії на ці процеси і призводить до зрушення в довгохвильову область спектра.
У деяких випадках збуджена молекула, стикаючись з ідентичною збудженою молекулою, утворює комплекс – ексимер. При цьому з плоских молекул виникають структури типу сендвіча, які стабілізовані переносом заряду від одної молекули до іншої. На перенесення заряду витрачається частина енергії поглиненого кванта, тому ексимер флуоресціює в більш довгохвильовій області. Ступінь ексимеризаціі залежить від концентрації хромофора, температури і в'язкості навколишнього середовища.
Поширеним флуоресцентним зондом, який використовується для вимірювання мікров'язкості мембран за легкістю його ексімерізації, є пірен. Пірен концентрується в гідрофобних компартментах мембрани, розташовуючись між жирнокислотними ланцюгами ліпідів. Його ексимеризація пропорційна рухливості молекул у бішарі, тому при інших однакових умовах і незмінній концентрації пірену величина ексимеризаціі може служити характеристикою мікров'язкості мембрани.
Зниження температури збільшує мікров'язкість бішару, обмежує рухливість молекул пірену і знижує рівень його ексимеризаціі. При зростанні температури рухливість ланцюгів жирних кислот у серцевині бішару зростає, збільшується і ймовірність зустрічі молекул пірену. Вивчення залежності ексімеризаціі пірену в мембранах від температури (або інших чинників) дозволяє з'ясувати відносну мікров'язкість мембранних структур і виявити область критичних температур, при яких спостерігається фазовий перехід у мембранах.