57. Фолдинг белков: молекулярные шапероны семейств Hsp60 и Hsp70 у

про- и эукариот.

Шаперонины (или шапероны Hsp60) – это двухкамерные бочкообразные структуры, сформированные двумя состыкованными олигомерными кольцами Hsp60, которые способны на своих противоположных поверхностях попеременно связывать и инкапсулировать белки, подлежащие рефолдингу. При этом шаперонины узнают гидрофобные кластеры белковых мишеней, находящихся в состоянии «расплавленной глобулы» – промежуточно между нативным и развернутым состояниями белка, характеризующимся ослаблением взаимодействий между боковыми группами в аминокислотной цепи Наиболее изученным является шаперонин GroEL E. coli, функционирующий в комплексе с кошаперонином GroES. Каждая субъединица гептамерного «кольца» GroEL состоит из трех доменов: апикального («верхушечного», Ар), содержащего общий

центр связывания ненативных белков и кошаперонина, шарнирного промежуточного (In) и С-концевого экваториального (Eq), несущего АТР-азный центр. Экваториальные домены обеспечивают бoльшую часть межсубъединичных контактов как внутри гептамерного кольца, так и между кольцами шаперона. Взаимодействие экваториальных доменов двух колец GroEL приводит к образованию зеркально симметричного тороида с двумя изолированными гидрофобными полостями (транс-состояние колец), входные отверстия которых сформированы апикальными доменами . Субъединицы кошаперонина GroES также образуют циклический гептамерный куполообразный комплекс, способный прикрывать один из торцов тороида GroEL. Это приводит к значительным конформационным изменениям шаперонина, увеличению размеров полости и ее гидрофилизации (цис-состояние кольца). Взаимодействие ненативных полипептидов с тремя или четырьмя из семи гидрофобных центров Ар-доменов фиксирует белок-мишень на открытом транс-кольце GroEL. При этом в соседнем цис-кольце происходит гидролиз АТР и рефолдинг ранее связанной мишени. Образование ADP в цис-кольце способствует кооперативному связыванию АТР во всех семи Eq-доменах транс-кольца , что приводит к снижению гидрофобности Ар-доменов и освобождению мишени. Одновременно происходит быстрое связывание кошаперонина GroES и переход кольца в цис-состояние, сопровождающийся инкапсулированием мишени в гидрофильную полость, где агрегация белка становится невозможной . Эти превращения индуцируют быстрое высвобождение сначала GroES и рефолдированной мишени, а затем ADP из соседнего кольца , и приводят к активации гидролиза АТР и рефолдинга мишени в цис-кольце . При этом за время около 20 с мишень претерпевает ряд структурных изменений, включая стадию разворачивания.

58. Рабочий цикл шаперонных комплексов GroEls и DnaKj-GrpE.

Тепловой шок является гомеостатическим ответом клетки на индуцированное

стрессовыми условиями изменение конформации белков. Этот феномен свойственен всем организмам, и его молекулярный механизм практически идентичен у бактерий, архей и эукариот (но детали рассматривать мы будем все-таки у E. coli). При повышении температуры клетка начинает синтезировать т.н. белки теплового шока, к которым прежде всего относятся молекулярные шапероны (DnaK, GroEL) и АТФ-зависимые протеазы (Lon, ClpAP). Эти белки выполняют две основные функции - обеспечивают фолдинг (сворачивание в нативную конформацию) и деградацию поврежденных белков. Несмотря на полную противоположность этих двух функций результат их осуществления один – ликвидация поврежденных (и потенциально опасных для клетки) белков. Цитоплазматические протеазы по своей структуре напоминают шапероны -

древние машины для фолдинга. И те, и другие распознают экспонированные гидрофобные

участки неправильно свернутых или денатурированных белков.

Молекулярные шапероны. Эти белки обеспечивают правильный фолдинг синтезируемых белков за счет энергии гидролиза АТФ. Они особенно важны у прокариот, где фолдинг обычно не является котрансляционным. Шапероны могут также вернуть в нормальную конформацию многие денатурированные белки (накапливающиеся при многих стрессах, включая тепловой шок), а также предотвращают агрегацию олигомеров и обеспечивают их разделение. Наконец, шапероны участвуют в секреции, поддерживая секретируемые белки в развернутом состоянии. Шапероны из семейств Hsp70 и Hsp60 (аббревиатура из слов heat shock protein + мол. масса) присутствуют в цитоплазме в наибольших количествах.

Основной принцип: аномальные белки находятся в частично денатурированном состоянии не могут спонтанно принять нативную конформацию за приемлемое для клетки время. Шапероны распознают аномальные белки по контактирующим с раствором гидрофобным (в нрме находящимся внутри глобулы). Взаимодействие гидрофобных поверхностей шаперонов с гидрофобными участками аномальных белков приводит к еще большей денатурации последних. Происхоящее затем конформационное изменение молекулы шаперона, зависящее от связывания либо гидролиза АТФ, приводит к высвобождению аномального белка в еще более денатурированном состоянии. Так белок получает шанс завершить фолдинг, минуя стабильную промежуточную конформацию.

E. coli также имеет дополнительные шапероны , такие как SecB, ClpB и IbpAB, взаимодействующие с белками, являющимися плохими субстратами для шаперонов Hsp70 и Hsp60 семейств.

У E. coli гомологом Hsp70 является DnaK, который образует комплекс с кошапероном DnaJ и белком GrpE. Белки, требующие помощи в фолдинге, опознаются аппаратом DnaK-DnaJ-GrpE, предположительно через находящиеся в контакте с раствором гидрофобные участки. . Эти шапероны не образуют крупных мультимерных комплексов, в полости которых мог бы происходить рефолдинг белка-субстрата. Вместо этого происходит локальное разрушение структуры белка в месте связывания шаперона, а если этого оказывается недостаточно для спонтанного рефолдинга в нативное состояние, процедура может повторяться неоднократно. Молекулярный шаперон затем, гидролизуя АТФ, "перетасовывает" конформацию многих оснований, фактически разворачивая белок и позволяя ему свернуться заново. Если нативная конформация не достигается таким путем, белок переходит в ведение шаперонина GroES-GroEL. Цикл шаперонов этого семейства достаточно сложен и включает взаимодействие с другими белками. В случае DnaK такими вспомогательными белками являются кошаперон DnaJ (белок семейства Hsp40) и белок GrpE.

Работает как мономерный белок. DnaK нужны два помощника для работы: Dnaj и GrpE. Гидрофобные АК смотрят наружу – белок неправильно свернулся – по такому принципу узнает шаперон. 1) Dnaj узнает неправильный белок и связывается с ним. 2) доставляет его в активный центр. DnaK связывается с белком. 3) гидролиз АТФ до АДФ, изменяется конформация 4) замена АДФ на АТФ, GrpE в составе шаперона. 5) шаперон отпускает белок.