17. Эксцизионная репарация нуклеотидов с помощью белков uvrAbc.
18. SOS-репарация.
Если клетка имеет повреждения, с кот не могут справится иные системы репарации, то включается SOS- репарация. Начало определяется взаимодействием белка RecA с белком – LexA, который выполняет функцию репрессора. Ответ клетки на повреждающее воздействие начинается с активации белка RecA (связывается с одноцепочными участками). RecA меняет свою конформацию, а затем связывается с LexA. Увеличение RecA, что приводит к протеолизу: разрезается LexA на маленькие кусочки. Ошибки исправляются. Прекращение действия индуцирующего сигнала вызывает потерю протеазной активности белком RecA. Однако к этому моменту ген lexA имеет очень высокий уровень экспрессии, поэтому при потере RecA-белком своей протеазной активности в клетке быстро накапливается необходимое количество активного LexA-репрессора, что приводит к выключению SOS-ответа. Именно такими взаимоотношениями белков RecA и LexA можно объяснить легкую обратимость SOS-ответа в клетке.
19. Рекомбинационная репарация.
Системы рекомбинационной репарации на примере удаления поврежденного участка, содержащего тиминовый димер, который по какой-либо причине не был удален одним из, описанных способов эксцизионной репарации или фотореактивации. При репликации поврежденный сайт (тиминовый димер) не может служить матрицей, направляющей синтез дочерней цепи. Репликативная машина пропускает этот димер, оставляя в дочерней цепи брешь. Репликация может возобновиться только на некотором расстоянии от димера дальше по цепи – например, в следующем сайте инициации фрагмента Оказаки. Поэтому брешь, оставляемая в дочерней цепи, может оказаться существенной. Образующиеся после репликации молекулы ДНК различны – одна содержит родительскую поврежденную цепь и дочернюю цепь с брешью, вторая содержит неповрежденную родительскую цепь и нормальную комплементарную ей дочернюю цепь.
В результате рекомбинационной репарации брешь напротив поврежденного участка первой молекулы ДНК застраивается при использовании отдельной гомологичной цепи другой молекулы ДНК. Образующаяся в результате такого одноцепочечного обмена молекула содержит родительскую (по-прежнему поврежденную) цепь, спаренную с нормальной дочерней цепью. Вторая молекула ДНК содержит нормальную родительскую цепь с комплементарной дочерней цепью, но уже имеющей брешь, которая застраивается в результате репарирующего синтеза. Таким образом, повреждение в молекуле ДНК сохраняется и события рекомбинационной репарации будут повторяться при каждом акте репликации до тех пор, пока повреждение не будет удалено системой эксцизионной репарации.
20. Механизм общей (гомологичной) рекомбинации: образование
гетеродуплексов, миграция ветви, разрешение структур Холлидея. Роль
белков RecA, RecBCD и RuvABC в рекомбинации у E.coli.
Гомологичная рекомбинация происходит при условии, что в последовательностях ДНК есть гомологичные участки протяженностью сотни и тысячи пар нуклеотидов, кроссинговер может произойти в любой точке гомологии.
Вносится двуцепочечный разрыв, который познее расширяется экзонуклеазами, однако цепи со свободными 3'-концами деградируют меньше, чем с 5'-концами, что приводит к тому, что 3'-конец выступает сильнее. Этот свободный 3'-конец спаривается с комплементарным участком гомологичной молекулы ДНК, вытесняя вторую цепь. Внедрившийся 3'-конец удлиняется ДНК-полимеразой, параллельно происходит процесс миграции ветвей, в результате чего образуется молекула ДНК с двумя точками кроссинговера – структкра Холлидея. После этого репликация восстанавливает ДНК отсутствующую в области исходного двунитевого разрыва.Проведенные in vitro эксперименты показали, что для осуществления процесса гомологичной рекомбинации достаточно 5 белков:
Если при репликации поврежденной ДНК образуется цепь с пробелом, то RecA обеспечивает обмен цепями и образование структуры Холлидея. ДНК-полимераза I застраивает одноцепочечные участки.
RuvAB обеспечивает быструю миграцию ветвей. А RuvC разрешает структуру Холлидея.
Белок RecA способен осуществить процесса замена ветвей, если субстратами являются кольцевая одноцепочечная ДНК или двунитевая кольцевая с пробелом в одной цепи и двунитевая линейная молекула с двуцепочечным разрывом. В процессе реакции образуются разветвленный интермедиаты, процесс требует энергии АТФ. Белковый комплекс RecBCD обладает хеликазной и нуклеазной активностью. Связываясь с концом двуцепочечной молекулы ДНК, он деградирует обе цепи с затратой АТФ. Дойдя до специфической последовательности – chi-сайта (встречается каждые 5-10 тысяч п.н.), деградация 5'-конца ускоряется, а 3'-конца замедляется, что приводит к образованию свободного 3'-конца. С этим свободным 3'-концом связывается белок RecA, это взаимодействие приводит к возможности атаки гомологичного участка двуцепочечной молекулы ДНК.
Быструю миграцию точки перекреста обеспечивает комплекс RuvAB. Два тетрамера RuvA связываются с 4 цепями ДНК, гексамер RuvB связывается вокруг гетеродуплекса и протаскивает ДНК через себя. RuvC обеспечивает разрешение структуры Холлидея, внося разрывы:
Два тетрамера RuvA связываются с 4 цепями ДНК, гексамер RuvB связывается вокруг гетеродуплекса и протаскивает ДНК через себя. RuvC обеспечивает разрешение структуры Холлидея, внося разрывы: