10. Характеристика днк-полимераз эукариот: размеры, субъединичный

состав, ферментативные активности и участие в процессах репликации и

репарации.

Функция третей субъединицы кор-фермента пока не выяснена.

11. Структура вилки репликации: события на ведущей и отстающей нитях.

Полунепрерывный синтез и фрагменты Оказаки. Участие в репликации

вспомогательных белков (SSB, хеликазы, праймазы, лигазы).

Вилка состоит из двух цепей: ведущая – синтезируется непрерывно и запаздывающая, которая синтезируется фрагментами Оказаки ( на 5-конце имеет несколько рибонуклеотидов, размер разный). В репликации принимают участие: хеликаза - раскручивает цепь, SSB белки связываются с однонитевыми участками и поддерживают их в таком состоянии. Праймаза синтезирует РНК-затравки. ДНК-пол 3 идет по основной цепи в направлении раскрытия вилки и синтез цепь. Другой своей частью она синтез фрагменты Оказаки. ДНК-пол 1продолжает удлинять фрагменты и гидролизует предыдущий фрагмент. Лигаза сшивает. 3′5′ экзонуклеазная активность обеспечивает контроль за присоединением каждого последующего нуклеотида и удаление ошибочно спаренного нуклеотида с растущего конца цепи ДНК. Способность ДНК-полимеразы I удлинять 3′-конец цепи, спаренной с матричной цепью, позволяет ей заполнять пробелы между отдельными сегментами в цепях ДНК. С помощью 5′3′ экзонуклеазной активности вырезаются небольшие, до 10 рибонуклеотидов, участки, которые являются затравками для синтеза фрагментов Оказаки. ДНК-полимераза  способна удлинять 3′-конец одной из цепей в месте разрыва и одновременно удалять нуклеотиды с 5′-конца того же разрыва.

12. Регуляция инициации репликации у e.Coli: структура участка старта

репликации (OriC), участие белков DnaA, DnaB, DnaC и DnaG в процессе

инициации.

Инициация репликации начинается с узнавания инициаторными белками специфических последовательностей в точках начала репликации ДНК.

Конечный ансамбль белков, обеспечивающий процесс репликации ДНК получил название – реплисома. Образование реплисомы у E. coli начинается, во-первых - с процесса взаимодействия активированных молекул белка dnaA в присутствии АТР с четырьмя специфическими сайтами, состоящими из девяти пар оснований в составе точки начала репликации и последующей олигомеризации этих белков с образованием 20-40-меров. По другим данным белок dnaA образует тетрамеры при связывании со специфическими сайтами в молекуле ДНК. Во-вторых, dnaA может образовывать комплексы, которые индуцируют плавление ДНК. И, в-третьих, dnaA с помощью dna C обеспечивают переход белка dna B (геликазы) в расплавленную или расплетенную область ДНК.

Белковый комплекс [dna B-dna C] обеспечивает формирование инициирующего «глазка», состоящего из нескольких сотен уже разделенных пар нуклеотидов . Важное значение геликаз, обеспечивающих разделение цепей ДНК, отражает то обстоятельство, что даже у такого простейшего одноклеточного организма, как E. coli обнаружено более 10 различных ферментов с геликазной активностью Одноцепочечные участки «глазка» стабилизируются особыми SSB-белками, которые взаимодействуют с одноцепочечной ДНК. На этой стадии, точка начала репликации практически подготовлена к синтезу РНК-праймера и последующему синтезу ДНК, который начинается с образования предзатравочного комплекса. Этот белковый ансамбль состоит из комплекса [dna B-dna C], с которым взаимодействуют четыре дополнительных полипептида. Образование праймосомы завершается после добавления к предзатравочному комплексу специфического фермента – праймазы (dna G), который синтезирует РНК-затравку, служащую началом фрагмента Оказаки (см. далее). Завершающим этапом сборки реплисомы –это взаимодействие праймосомы с ДНК-полимеразой 3. Для продолжения синтеза ДНК необходимо участие еще двух белков, двигающихся впереди репликативной вилки и выполняющих функцию геликаз – геликазы и белка rep.

Геном E.coli в единственую кольцевую молекулу ДНК размером 4,6*10(6) п.н. репликация днк начинается в единственной точке репликации-инициации. После того как вилки будут собраны в точке начало репликации. Синтез днк идет с постоянной скоростью. Пока репликация не будет завершена. Процесс начинается, когда копии инициаторных белков связываются с опред участками в точке начала репликации, вклиниваются в днк и формируют днк белковый комплек[dna B-dna C] + ДНК-хеликаза, хеликаза начинает раскручивать ДНК, открыв достаточно одиночной ДНК для того чтобы праймаза синтезировала РНК-затравку, которая положит начало ведущей цепи—образование репликацивной вилки.

Точки начала репликации у про и эукариот имеют два набора поворов:

У E.coli oriC состоит из ис-элементов(ЛМР) и 9-меры(2 –ттат…),состовляет 245 н.п.

У дрожжей сахаромицес церевизия имеется ARS(50н.п), кот имеет 2 компонента: элемент узнавающий инициатора и область,пред собой легко расплетаемый участок ДНК-ДuE. Для функционирования точки нужно еще 3 последовательности В1(основной),В2,В3. мутации элементов В снижают эффективность инициации. А так же мутация элемента А блокирует инициацию.

Метилирование ДНК происходит в последовательности GATC, 11 из которых обнаружены в точке начала репликации. В метилированном состоянии точка начала репликации связана с белком-ингибитором (Seq A), который блакирует доступ инициаторных белков к этому участку ДНК. Метилирование наполовину точки начала репликации полностью метилируется ферментом ДНК-метилазой, белок Seq A отделяется. За метилирование всех последовательностей GATC отвечает фермент – метилаза Dam. Задержка метиилрования после репликации используется также системой коррекции ошибок спаривания-для распознавания синтезированной нити ДНК от материнской

При терминации репликации вилки должны быть остановлены и демонтированы. Движение вилок останавливают специальные последовательности ДНК – ter элементы в хромосоме. Общая их черта – консенсусная последовательность в 23 пн, которая служит сайтом связывания продукта гена tus – 36 кДф белка, необходимого для терминации. Tus связывается с консенсусом т оказывает антихеликазное действие, останавливая распдетение ДНК DnaB. Ведущая цепь в продолжение своего синтеза лежит вплотную к ter элементу, в то время как ближайщая инициация фрагмента отстающей цепи отодвинута от ter на 50-100 пн. Tus останавливает движение репликативной видки лишь в одном направлении. Белок tus связывается с ДНК асимметрично. Альфа-спирали белка удерживают двойную спираль с конца, что блокирует репликативную вилку. Вилка, идущая в противоположном направлении, может сместить tus и продолжить свое движение. DnaA- АТФ активна, DnaA уходит, приходит DnaC(привлекает хеликазу) DnaB(хеликаза, разворачивает днк), DnaG(праймаза).