24)Этапы получения рекомбинантных молекул

Под рекомбинантными понимают ДНК, образованные объединением in vitro (в пробирке) двух или более фрагментов ДНК, выделенных из различных биологических источников. Фрагменты ДНК, в том числе и фрагменты, содержащие гены, получают с использованием ферментов рестриктаз. Рестриктазы могут образовывать фрагменты как с тупыми, так и с липкими концами.

В исследованиях по генной инженерии часто используют кишечную палочку Е. coli. Геном этой бактерии представлен одной хромосомой (молекулой ДНК), прикрепленной к мембране, и плазмидами, «плавающими» в цитозоле. Плазмида представляет собой кольцевую ДНК; 

Для получения рекомбинантной ДНК плазмиды выделяют из Е. coli и удаляют из них часть кольцевой молекулы ДНК. Для этого применяют рестриктазы. Комплементарные цепи молекулы ДНК разрезаются в разных местах, в результате чего образуются «липкие» концы — неспаренные участки цепей, способные присоединять комплементарные им полинуклеотиды. На фрагменте ДНК, выбранном для пересадки, тоже создают «липкие» концы, используя ту же рестриктазу, и, следовательно, на фрагменте ДНК образуются «липкие» концы, комплементарные «липким» концам рестриктированной плазмиды. Если теперь смешать фрагмент ДНК (ген) и плазмиду, то они соединятся «липкими» концами. Затем с помощью фермента лигазы образуют фосфодиэфирную связь между концевыми нуклеотидами обеих молекул, и вновь получают кольцевую молекулу ДНК, но теперь она вместе с плазмидной ДНК содержит ген, выбранный для пересадки. Это и есть рекомбинантная ДНК, т. е. ДНК, содержащая новую комбинацию последовательностей (или генов).

25)Метод бумажных дисков

Биологическая активность антибиотиков выражается в международных единицах (ME). За единицу активности принимается то минимальное количество антибиотика, которое задерживает рост стандартного штамма, определенного вида микроорганизма в строго определенных условиях. Степень чувствительности к антибиотикам необходимом определять для успешного проведения лечения. Наиболее распространен метод «бумажных дисков»: в чашку Петри с МПА «газоном» засевают взвесь изучаемой культуры микроба. На засеянную поверхность агара пинцетом накладывают бумажные диски, пропитанные антибиотиками. Диски располагают на равном расстоянии друг от друга и на расстоянии от края чашки 15 мм. Чашки выдерживают в термостате 18-20 часов при температуре 37 °С. Учёт результатов проводят на 2-ой день путем измерения зон задержки роста. Диаметр зоны задержки роста: Меньше 10 мм - штамм устойчивый 11-15 мм - штамм малоустойчивый 15-25 мм - штамм чувствительный больше 25мм - штамм высокочувствительный.

26)Бактериологич. Диагностика дисбактериоза киш-ка.

Наиболее прост качественный метод исследования. Он позволяет выявить качественные изменения облигатной (постоянной) и факультативной (привнесенной) микрофлоры кишечника. В основе его лежит определение процентного соотношения колоний микроорганизмов.

Методом, отвечающим требованиям клиники, является количественный метод с обязательным посевом на бифидобактерии. Он же позволяет выявить снижение или повышение содержания кишечной палочки, ее гемолитических (расщепляющих белки) или лактозонегативных колоний, количество стафилококка и энтерококка. В основе метода лежит подсчет указанных микроорганизмов на 1 г фекалий. Выявление бактерий типа протея в любом количестве есть проявление кишечного дисбактериоза.

Состояние анаэробной микрофлоры кишечника (бифидобактерии) осуществляется указанием минимального разведения, в котором она выявляется. Доказательством наличия дисбактериоза является отсутствие роста бифидобактерии в разведении 10/7, резкое снижение количества кишечной палочки (менее 1 млн) при среднем содержании 300-400 млн на средах Эндо и Левина и 800 млн - на кровяном агаре, появление расщепляющей белки кишечной палочки, лактозонегативных бактерий более 20 млн/г, расщепляющего белок стафилококка и протея, грибковых микроорганизмов типа кандида, а также в случаях, когда кокковая микрофлора кишечника составляет более 25 % от количества кишечной палочки.