Культуры клеток

Культивирование клеток in vitro – это выращивание в контролируемых условиях отдельных клеток бактерий или многоклеточных организмов. Контролируемые условия подразумевают создание оптимальных для данного типа клеток условий, обеспечивающих:

- питание (соотношение питательных веществ и стимуляторов роста)

- газообмен (определенный состав газовой среды)

- удаление продуктов метаболизма,

- температурный режим

- асептические условия (путем добавлением антибиотиков).

Впервые культура клеток зачатка нервной системы зародыша лягушки в капле лимфы получена Р.Гаррисоном в 1907.

При благоприятных условиях содержания культуры тканей удается поддерживать на протяжении многих лет.

Клетки выращивают поверхностным или глубинным способом. В первом случае клеточный рост происходит только на поверхности жидкой или сыпучей питательной среды. При глубинном культивировании размножение клеток идет во всем объеме питательной среды.

Клеточные культуры представляют практический интерес:

- как источник биомассы (например, культура фибробластов кожи для лечения ожогов);

- как продуценты ценных веществ (например, инсулина). Выделенные из природных объектов клетки обычно не способны синтезировать ценные метаболиты в достаточных количествах, поэтому необходимо целенаправленное улучшение их свойств. Усовершенствование продуцента проводят путем селекции спонтанных мутантов, индуцированного мутагенеза или генетической трансформации. Генетическая трансформация – введение в клетки чужеродных генов и получение трансгенных клеток или организмов, не встречающихся в природе. Трансгенные организмы в результате приобретают способность синтезировать нужное вещество, например ценный фармацевтический продукт.

Использование культур бактериальных клеток. Для бактерий клонирование является единственным способом размножения. Однако обычно, когда говорят о клонировании бактерий, имеют в виду намеренное размножение какой-либо бактерии, выращивание её клона, культуры. В настоящее время культуры бактерий находят широкое применение в фармацевтической промышленности. На основе бактериальной биомассы готовят вакцины, пробиотики (бифидумбактерин, колибактерин, лактобактерин), компоненты лечебного и спортивного питания (гидролизат пивных дрожжей). Бактерии используют для получения антибиотиков, гормонов, витаминов, аминокислот. Например, клетки кишечной палочки, способные к синтезу человеческого инсулина, соматотропина или иммуноглобулинов.

Культуры растительных клеток. Растительные клетки достаточно легко размножаются в культуре благодаря свойству тотипотентности – способности полностью реализовать наследственную информацию, т.е. обеспечивать развитие всего растения. Самый распространенный тип культуры растительных клеток – каллусная культура. Каллус представляет собой массу недефференцированных, постоянно делящихся клеток, способных дать начало целому растению. В естественных условиях каллусная ткань образуется на месте поранения и способствует зарастанию ран, срастанию прививок и т. д. Возможно использование меристемы - интенсивно делящихся клеток, активных на протяжении всей жизни. Экспериментально каллус получают, помещая фрагмент растительной ткани на питательную среду, содержащую фитогормоны и стимуляторы роста (ауксины и цитокинины).

Культуры растительных клеток применяют для получения ценных метаболитов, например: панаксозидов женьшеня (общеукрепляющее средство), дигогсина наперстянки шерстистой (кардиостимулятор), шиконина воробейника аптечного (противовоспалительное, противоожоговое средство).

Культуры животных клеток. Культивировать животные клетки значительно труднее, чем растительные. Причин этому несколько:

1) животные клетки требуют более сложных по составу питательных сред, присутствия разнообразных факторов роста;

2) животные клетки не обладают свойством тотипотентности. Дифференцировка клеток начинается еще на ранних этапах эмбрионального развития, происходит многоэтапно, вернуть клетки в дедифференцированное состояние не удается;

3) интенсивность роста и продолжительность существования в культуре зависит от возраста клеток. Эмбриональные ткани легко переходят в культуру, давая хороший прирост биомассы. Напротив, перевод в культуру клеток из взрослых организмов требует значительных усилий. Прирост биомассы невелик из-за присутствия неделящихся специализированных клеток. Продолжительность жизни культуры эмбриональных тканей, больше, чем взрослых. Это объясняется старением клеток: животные клетки имеют предел деления (предел Хейфлика) – 50-60 циклов митоза. Исключение составляют опухолевые клетки, способные к неограниченному росту.

В настоящее время культуры животных клеток широко используются в цитологии и биохимии в научных целях: для изучения действия различных факторов на внутриклеточные процессы. В фармакологии эксперименты на культурах клеток заменяют опыты на животных.

В практической медицине культуры животных клеток используют для получение клеточных продуктов. Культуры животных клеток рассматривают в качестве потенциальных продуцентов продуктов медицинского назначения.

Так, клетки опухоли гипофиза, надпочечников могут служить источником соответствующих гормонов, клетки нейробластомы – продуцентом фактора роста нервной ткани, фибробласты и лейкоциты – источником интерферона. Однако из-за технических сложностей эти технологии пока не находят широкого применения (т.к. обладают низкой скоростью роста и малой продуктивностью, требуют дорогих питательных сред).

Более широкое применение находит использование куриных эмбрионов для получения вакцин. Через прокол в яичной скорлупе вкалывают суспензию вирусов. Через 2-4 суток вирусы размножаются настолько, что вызывают гибель эмбриона. После этого вирусные частицы выделяют и инактивируют. Таким образом получают вакцины против гриппа, бешенства, паротита, желтой лихорадки.

Для лабораторной диагностики ряда заболеваний необходимы наборы специфических антител, так называемые моноклональные антитела. Моноклональными их называют по тому, что они являются клоном одной клетки-предшетвенницы. Их получают с помощью культуры гибридом – продуктов слияния лимфоцитов, синтезирующих нужные антитела, и опухолевых клеток. В отличие от обычных лимфоцитов гибридомы могут неограниченно долго существовать в культуре. На основе моноклональных антител создают препараты нового поколения для лечения рака. Их роль заключается в связывании белков-антигенов на поверхности раковых клеток: они подставляют раковые клетки под удар иммунной системы, могут нести и токсические агенты для их уничтожения. Подобная лекарственная терапия оказалась более эффективной, не вызывающей тяжелых побочных эффектов, как стандартная химиотерапия. Это не ковровая бомбардировка организма (как химиотерапия), а оружие точного поражения. За разработку технологии получения моноклональных антител немецкий иммунолог Горг Келлер и британский биолог Сезар Мильштейн в 1984 году получили Нобелевскую премию по физиологии и медицине. Такие лекарственные препараты используют в нашей стране с 2000 года сначала для лечения неходжкинской лимфомы, потом при раке молочной железы, колоректальном раке, раке легкого. Проблема в доступности таких препаратов, их стоимости (решение – создание биоаналогов).

Применение культур животных клеток в травматологии при заживлении сложных ран и травм, для реконструкции различных тканей и органов. Так, культура клеток кожи используется для заместительной терапии при ожогах, культура клеток эндотелия для реконструкции стенок сосудов.

В последние десятилетия развиваются методы клеточной терапии - лечения стволовыми клетками. Стволовые клетки – это недифференцированные клетки, способные к практически неограниченному делению и дифференцировке в специализированные клетки организма. Часто это их единственная функция, как, например, у зиготы и эмбриональных клеток до стадии бластоцисты. Созревание стволовых клеток проходит в несколько стадий, поэтому в организме имеется ряд популяций стволовых клеток различной степени зрелости. Чем более зрелой является клетка, тем меньше вероятность того, что она сможет превратиться в клетку другого типа. Во взрослом организме стволовые клетки находятся, в основном, в костном мозге, единичные клетки разбросаны по другим органам и тканям. Они обеспечивают восстановление поврежденных органов и тканей. Получив сигнал о повреждении, стволовые клетки мигрируют к ране и здесь превращаются в необходимые организму клетки (костные, мышечные, нервные и др.), тем самым, облегчая регенерацию.

В медицине стволовые клетки находят применение при лечении инфарктов, переломов, травм внутренних органов. У пациента берут стволовые клетки, размножают вне организма и потом вводят в зону поражения. Поскольку стволовые клетки могут быть получены от самого пациента, снимается проблема тканевой несовместимости. Однако остаются неясными отдаленные последствия такой терапии, существует вероятность злокачественного перерождения.

В мире развивается направление тканевой или органной терапии, в рамках которой ведутся пионерские работы по выращиванию целых искусственных органов. Стволовые клетки пациента выращивают на биосовместимом каркасе нужной формы. Для формирования в будущем органе системы кровоснабжения внутрь каркаса помещают микротрубочки из другого полимера. Деление и дифференцировку стволовых клеток вызывают путем добавления в питательную среду специальных факторов роста. Некоторые исследователи предлагают выращивать орган непосредственно в организме пациента. Каркас будущего органа вживляют в область тела с хорошим кровоснабжением (подкожную-жировую клетчатку, брюшную полость или толщу мышц). После формирования органа его трансплантируют на постоянное место. Большинство описанных экспериментов пока проводятся на животных. Удачные операции на человеке были проведены по трансплантации искусственного мочевого пузыря, фрагментов трахеи, хрящевой ткани колена.

С возрастом число стволовых клеток у человека резко сокращается: если в костном мозге новорожденного 1 стволовая клетка приходится на 10000 обычных, то в 70 лет это соотношение составляет 1 : 1000000. Выделить их становится сложно, поэтому в последние годы стали разрабатываться государственные программы криосохранения стволовых клеток пуповинной крови и плаценты. Эти клетки могут стать своего рода страховкой от будущих серьезных травм.