Трансплантация зародышей – оценка зигот и их хранение. Время и техника пересадки зигот

ОЦЕНКА, КУЛЬТИВИРОВАНИЕ И ХРАНЕНИЕ ЗАРОДЫШЕЙ

Специальные исследования свиде-тельствуют, что частота отклонений от нормы у яйцеклеток, выделившихся во время суперовуляции, более высокая, чем при овуляции у животных без гор¬мональных обработок. Поэтому после суперовуляции оплодотворяются не все яйцеклетки, а из оплодотворившихся яйцеклеток не всегда развиваются пол¬ноценные зародыши, пригодные к пере¬садке. В связи с этим для достижения высоких результатов отбирают зароды¬шей, способных к дальнейшему разви¬тию в организме реципиента. Наиболее широкое распространение получили способы оценки качества и жизнеспо¬собности зародышей по морфологичес¬ким признакам и по результатам их культивирования.

Морфологическую оценку зароды¬шей проводят с использованием инвер-тированного микроскопа МБИ-13. При этом учитывают соответствие стадии развития зародыша его возрасту, целос¬тность и форму прозрачной оболочки, равномерность дробления бластомеров и состояние их цитоплазмы, величину и прозрачность перивителлинового про-странства. Зародыши с признаками де-генерации, уродств и недоразвития для пересадок непригодны. (Подробно ме¬тодика изложена в «Практикуме по аку¬шерству, гинекологии и искусственно¬му осеменению сельскохозяйственных животных».)

После морфологической оценки за-родышей до пересадки можно кратко-временно хранить в термостате при тем-пературе 37 °С. При этом их помещают на часовое стекло в 0,5 мл среды Дюль- бекко с добавлением 20 % фетальной сыворотки теленка или сыворотки овцы. Часовые стекла с зародышами ставят в чашки Петри, на дно которых кладут увлажненную фильтровальную бумагу. Таким образом сохраняется жизнеспособность зародышей и обеспе¬чивается возможность более точного выявления их полноценности.

Для замораживания зародышей го¬товят среду из следующих компонен¬тов (в г/л): натрия хлорид 8,0; калия хлорид 0,2; гидроортофосфат (динат- рийфосфат) безводный 1,15; дигидро¬ортофосфат (монокалийфосфат) одно- замещенный 0,2; магния хлорид, со¬держащий 6 молекул воды, 0,1; калия хлорид безводный 0,1; натрия пируват 0,076; глюкоза 1,0. В этот раствор до¬бавляют 20 % фетальной сыворотки крови теленка и 100 тыс. ЕД/л пени¬циллина (калиевой соли). Среду гото¬вят в стерильных условиях в день при¬менения. Часть среды используют для приготовления рабочего раствора (к 8 мл среды добавляют 1000 ЕД пени¬циллина и 2 мл фетальной сыворотки). Затем готовят серию растворов с раз¬ной концентрацией глицерина по ме-тодике, изложенной в инструкции, и насыщают зародыш глицерином од¬но- или многоступенчатым способом. Этот процесс контролируют под мик¬роскопом в стерильных условиях при температуре 20 °С, после чего зароды¬ши сразу замораживают в стеклянных пробирках или ампулах, пластиковых соломинках, которые маркируют.

Охлаждение проводят в несколько этапов: 1) снижают температуру от 20 °С до минус 5—7 °С со скоростью 1—10 °Св 1 мин; 2) при минус 6—7 °С проводят ис-кусственную кристаллизацию, касаясь пинцетом, переохлажденным в жидком азоте, поверхности контейнера с заро-дышами; 3) продолжают охлаждать со скоростью 0,3 °С в 1 мин до минус 36 °С; 4) погружают в жидкий азот для быстро¬го охлаждения до минус 196 °С. Хранят замороженные эмбрионы в сосудах Дьюара. Для оттаивания емкости с заро¬дышами быстро переносят в водяную баню с температурой 25—37 °С и держат до исчезновения льда.

Вместе с раствором криопротектора эмбрион помещают на часовое стекло, предварительно оценивают под лупой и удаляют криопротектор, помещая заро¬дыш в заранее приготовленные раство¬ры глицерина убывающей концентра¬ции. Затем еще раз оценивают качество зародышей под микроскопом. Когда эм¬брионов замораживают в соломинках с раствором глицерина и сахарозы, то после оттаивания соломинку несколько раз встряхивают (подобно термометру). При этом пробка, закрывающая соло¬минку, должна быть направлена вверх. Для уравновешивания осмотического давления и удаления криопротектора из зародыша соломинку помещают верти¬кально (пыжом вверх) в водяную баню с температурой 25—37 °С. Затем присту¬пают к пересадке эмбриона (Н. И. Сер¬геев, С. А. Мазепкин).

Разработаны и другие способы куль-тивирования зародышей вне организма, позволяющие сохранять их жизнеспо-собность до 24—48 ч. Зародышей можно культивировать в пробирках, а также в ампулах и пайетах из поливинилхлори¬да. До 4—7 дней сохранить их можно в перевязанном яйцепроводе кролика. Однако наиболее перспективным мето¬дом является глубокое замораживание зародышей в жидком азоте при темпера¬туре минус 196 °С. Зародыши крупного рогатого скота лучше других переносят замораживание и размораживание; вы¬живаемость — 50—70 %.

Пересадка в след вопросе