2. Понятие о молекуле - хронометре

Включение филогении в таксономию основано на общепринятом правиле: бактериальная класси­фикация должна как можно точнее отражать при­родное родство между бактериями.

Фило­гения - это наука, исследующая эволюцию и раз­витие видов. Молекулы в их порядковом располо­жении компонентов являются "документами" исто­рии эволюции и могут быть использованы как ин­струменты для филогенетического изучения. Так как строение рибосомы является критичным для функции клетки и она взаимодействует с большим числом других молекул, включая молекулы мРНК и тРНК, последовательности молекул основной рРНК высококонсервативны на протяжении эволюции. Чем больше времени прошло с начала дивергенции двух организмов от одного пред­шественника, тем большее число мутационных различий будет аккумулироваться в этих молеку­лярных последовательностях. Определяя различия последовательностей между организмами, можно реконструировать их филогенетические связи.

Выбор рРНК для решения проблем эволюционной системати­ки прокариот оказался удачным по ряду причин: эти молекулы обнаружены у всех клеточных форм жизни, что указывает на их древнейшее происхождение; их функции всегда одинаковы; пер­вичная структура в целом характеризуется высокой консерватив­ностью. Особенностью рРНК является нахождение вне сферы дей­ствия отбора, поэтому данные молекулы эволюционируют в ре­зультате спонтанных мутаций, происходящих с постоянной скоростью, и накопление таких мутаций зависит только от време­ни. Таким образом, мерой эволюционного расстояния между орга­низмами служит количество нуклеотидных замен в молекулах срав­ниваемых рРНК.

Известно, что в рибосомах прокариот и эукариот присутствуют 3 типа рРНК, различающихся молекулярной массой и коэффици­ентом седиментации. Информационная емкость крупных молекул больше, но их труднее анализировать. Поэтому наиболее удобным оказался анализ молекул рРНК средней величины: 165 (у прокари­от) и 185 (у эукариот), состоящих из 1600 и 2500 нуклеотидов соответственно. Так как молекулы рРНК у бактерий и организмов-эукариотов, вклю­чая человека, достаточно сходны, их можно было сравнить и, следовательно, получить надежные филогенетические данные. Многие бактерии подразделены на группы, называемые суперсемействами рРНК, на основе сходства последовательностей рРНК, которые соответствуют эволюционным раз­ветвлениям во времени. Существующие данные позволяют более легко распределять новые и повторно тестируемые штаммы в уже имеющиеся группы семейств родственных микроорганизмов, так как в настоящее время доступно более чем 2000 последовательностей рРНК. Источниками базы данных являются Ribosomal Database Project, GenBank и European Molecular Biology Laboratory (EMBL). Доступен также ряд методов и компьютерных программ для реконструкции филогенетического родства на основе данных о последователь­ностях.

Молекулы 16S рРНК, помимо консервативных участков, содержат высоковариабельные области длиной 20—30 пар оснований, которые являются совершенно уникальными для любого вида бакте­рий, конструирование ДНК-зондов, основанных на последовательностях этих уникальных облас­тей-мишеней, является чрезвычайно полезным для идентификации бактериальных видов.

В последнее время для типирования рРНК используется целый ряд новых молекулярно-генетических методов, таких как ПЦР в многочисленных ее модификациях, разнообразных методов геномной дактилоскопии, методов автоматического секвенирования нуклеотидных последовательностей и др. Но в филогении бактерий сейчас получает основное преимущество технология секвенирования 16S и 23S рРНК с помощью ПЦР. Данный генетический метод позволяет анализировать множество штаммов, что увеличивает достоверность исследований и да­ет возможность использовать его для исследований популяционной генетики микроорганизмов. Вместе с тем до абсолютного секвенирования, т. е. се­квенирования всего генома микроорганизма, еще далеко. Однако очевидно, что чем больше анали­зируемые консервативные элементы, тем большую информацию они несут и тем более достоверны ре­зультаты, а следовательно, точнее идентификация и классификация микроорганизмов. Предполага­ется, что в первое десятилетие нашего тысячелетия будут получены нуклеотидные последовательности более чем 100 наиболее значимых микробных па­тогенных видов и для этих возбудителей будут ус­тановлены как всеобъемлющие филогенетические, так и таксономические отношения. Коротко рассмотрим метод ПЦР-технологии.

ПЦР- полимеразная цепная реакция. В настоящее время ПЦР представляет процесс, протекающей в одной пробирке и состоящий из повторных циклов амплификации (размножения, копирования) специфической последовательности молекул ДНК или РНК с целью получения достаточно большого количества копий, которые могут быть выявлены обычными методами детекции. Одним из ключевых компонентов реакции являются «праймеры» - синтетические олигонуклеотиды, состоящие из 20-30 оснований, комплементарных «сайтам» (участкам) отжига (присоединения) на идентифицуруемой матричной нуклеиновой кислоте. Каждый цикл ПЦР состоит из трех стадий: денатурации, отжига и удлинения. Во время денатурации нити НК разъединяются и становятся доступными для праймеров. Отжиг – присоединение праймеров к сайту нити НК. Удлинение – присоединение имеющихся в реакционной смеси коротких нуклеотидов по принципу комплементарности. ПЦР протекает автоматически в программируемом термостате – амплификаторе. Трехступенчатый цикл, в результате которого получаются точные копии идентифицируемого участка матричной НК повторяется 30-50 раз. Количество копий нарастает в геометрической прогрессии. Выявление или детекция амплифицированной НК проводится в основном с помощью электрофореза. Будучи выявленным, организм далее идентифицируют с помощью секвенирования амплифицированной рРНК и сравнения последовательности с известными последовательностями рРНК. В другой модификации ПЦР для клинической микробиоло­гии видо- и родоспецифические праймеры могут использоваться для определения специфического подозреваемого микроорганизма в инфицируемом материале или смешанных культурах. Этот метод поле­зен как для выявления некультивируемых организ­мов, так и для более быстрой идентификации медленнорастущих микроорганизмов, таких как микобактерии.

К настоящему времени последовательности 16S и 18 S рРНК изучены у многих организмов, принадлежащих к разным царствам живой природы. На основании полученных дан­ных рассчитаны коэффициенты сходства сравниваемых организ­мов, что привело к неожиданным результатам: выявлены не две группы организмов, различающихся прокариотным и эукариотным типом клеточной организации, а три. Одну образуют все эукариоты: высшие растения, животные, дрожжи, водоросли и т.п. В эту группу не вошли органеллы эукариот (митохондрии, хлоропласты). Таким образом, первая группа представлена ядерно-цитоплазматическим компонентом эукариотных клеток. Ко второй группе, получившей название истинных бак­терий, или эубактерий, относится подавляющее большинство прокариот. Сюда же попали на основании степени гомологии 16S рРНК митохондрии и хлоропласта эукариотных клеток. Наконец, в третью группу вошли некоторые малоизученные прокариоты, обитающие в экстремальных условиях: метанобразующие бакте­рии, экстремальные галофилы и термоацидофилы. Эта группа орга­низмов получила название архебактерий.

Хотя клетки архебактерий структурно относятся к прокариотному типу, они построены из макромолекул (липидов, полисахаридов, белков), многие из которых являются уникальными и не синтезируются ни эукариотами, ни эубактериями. Архебактерии осуществляют ряд биохимических процессов, не свойственных остальным живым организмам. На основании этого был сделан вывод, что архебактерии, по-видимому, представляют собой одну из самых древних групп живых существ.

Обнаружение в недрах мира прокариот группы архебактерий поставило заново вопрос о путях клеточной эволюции с момента возникновения некоей гипотетической первичной клетки.

Традиционная общая схема клеточной эволюции основывается на следующих предположениях: из популяции первичных клеток в результате целого ряда событий, приведших к повышению уровня клеточной организации, под давлением естественного отбора возникла популяция предковых прокариотных клеток, из которых в конечном итоге произошли разные группы прокариот. Эукариотная клетка возникла в результате эндосимбиоза, в котором ядерно-цитоплазматическим компонентом, т. е. клеткой-хозяином, и эндосимбионтами, превратившимися впоследствии в митохондрии и хлоропласты, были существенно различающиеся между собой прокариотные клетки (рисунок А). Следствием такого взгляда на общий ход эволюции явилось признание двух основ­ных царств живых организмов — Prokaryotae и Eukaryotae.

Прогеноты

А Б

Рисунок 1. Пути клеточной эволюции.

Тонкими стрелками обозначено эволюционирование разных групп прокариот, в том числе давших начало митохондриям (1), хлоропластам (2), эукариотному ядру и цитоплазме (3). Жирными стрелками обозначено эволюционирование разных групп эукариот