Теории, объясняющие механизм взаимодействия фермента и субстрата.

Теория Фишера – теория предшествующего соответствия, теория «ключ – замок». Согласно теории активный центр фермента существует и точно соответствует субстрату.

Недостатки (противоречия) теории:

1. Нет соответствия в термодинамических расчетах (разница в расчетном количестве выделяемой энергии и практически выделяемом количестве энергии).

2. По этой теории фермент может ошибаться и присоединять похожий субстрат.

3. Субстраты часто низкомолекулярные вещества, а ферменты высокомолекулярные, содержащие большое число аминокислот. Теория не объясняла существование групповой специфичности.

Теория Кошленда – индуцированного соответствия, т.е. активный центр формируется в момент взаимодействия фермента и субстрата, т.е. происходит подгонка. В субстрате происходит изменение связей. Наличие активных центров определяют специфичность.

Виды специфичности.

1. Абсолбтная – одному субстрату соответствует один фермент.

Уреаза катализирует расщепление мочевины, аспартаза катализирует взаимодействие NH₃ с фумаровой кислотой, в результате образуется аспарагиновая кислота, но аспартаза не действует на малеиновую кислоту.

СООН COOH

| |

CH CH₂

|| |

CH CHNH₂

| |

COOH COOH

Фумарат Аспартат

2. Относительная групповая специфичность. Фермент расщепляет группу субстратов, для которых характерен один тип связей.

Пример: пепсин расщепляет пептидную связь –CO-NH между аминокислотами.

Аналогично действуют трипсин, химотрипсин, пептидазы.

Химотрепсин расщепляет пептидные связи между три, тир и фен, но при определенных условиях могут расщеплять амидные и сложноэфирные связи.

3. Стереохимическая специфичность – фермент обеспечивает превращение определенного оптического (стереоизомера). В организме происходит превращение L-аминокислот, но D-углеводов.

Фумараза катализирует превращение фумаровой кислоты (транс-изомер), но не действует на малеиновую кислоту (цис-изомер).

При исследовании специфичности ферментов было установленно, что молекула субстрата должна обладать двумя структурными особенностями:

1. Субстрат должен содержать специфическую химическую связь, которую фермент мог атаковать.

2. В молекуле субстрата должна быть функциональная группа, называемая связывающей группой, которая способна связываться с ферментом и ориентировать молекулу субстрата в активном центре фермента, чтобы атакуемая связь субстрата была правильно расположена по отношению к каталитической группе фермента.

Изоферменты.

Изоферменты – это множественные формы ферментов.

Изоферменты отличаются по сродству к субстрату, по максимальной скорости катализирумой реакции (по активности), по электрохимическим свойствам, по константе Михаэлиса, по тканевой локализации.

Изоферменты состоят из нескольких субъединиц.

Примером изоферментов является лактатдегидрогеназа (ЛДГ), катализующая реакцию превращения пир лак и наоборот.

ЛДГ состоит из 4 субъединиц двух разных типов – Н и М и в результате комбинаций образуется 5 изоферментов:

ЛДГ₁ – Н₄

ЛДГ₂ – Н₃М

ЛДГ₃ – Н₂М₂

ЛДГ₄ – НМ₃

ЛДГ₅ – М₄

Изоферменты отличаются по молекулярной массе, электрофоретической подвижности, по отношению к активаторам и ингибиторам.

Для каждой ткани в норме характерно свое соотношение форм (изоферментный спектр) ЛДГ.

В сердечной мышце преобладает ЛДГ₁ (Н₄), а в скелетных мышцах и печени ЛДГ₅ (М₄).

Это свойство изоферментов используется в клинике для дифференциальной диагностики органических и функциональных поражений органов и тканей. По изменению содержания изоферментов в сыворотке крови судят о нахождении патологического процесса, так и о степени поражения органа или ткани.

Витамин	Коферментная форма	Переносимая группа	Тип катализируемой реакции
В1 тиамин	ТДФ- тиаминдифосфат ТПФ (ТТФ) - тиаминпирофосфат	Отщепление СО2	Окислительное декарбоксилирование
В2 рибофла-вин	ФМН – флавинмононуклеотид ФАД – флавинаденин-динуклеотид	Протоны (Н+) и электроны ( )	Дегидрирование
В3 пантоте-новая кислота	HSKoA – (аш эс коэнзим А)	Ацильная группа (R-C=O) |	Ацилирования
В5 никотин-амид	НАД – никотинамидаде-ниндинуклеотид НАДФ – никотинамид-адениндинуклеотид фосфат	Протоны и электроны	Дегидрирование
В6 пиридок-саль	ПФ – пиридоксаль фосфат	NH2-группа (амино-группа)	Трансаминирование
В7 биотин	Коферментной формой является сам витамин	СО2	Карбоксилирование
В9,10 фолиевая кислота	ТГФК – тетрагидро-фолиевая кислота ТГФК-СН3 – метилтетра-гидрофолиевая кислота, СН2ОН–ТГФК – гидроксиметилен, ТГФК-С=О – формил- | ТГФК Н	Перенос одноуглерод-ных фрагментов: метил – СН3, гидрокси-метилен - СН2ОН, формил –С=О | H
В12 кобал-амин	СН3-В12 – метил-кобаламин, ДА-В12 – дезоксиаденозил кобаламин	Перенос метильной группы СН3	Трансметилирование

Факторы, влияющие на активность ферментов.

1. Концентрация субстрата [S]

2. Концентрация фермента [F]

3. Температура

4. рН

5. Низкомолекулярные вещества (активаторы, ингибиторы).

Концентрация субстрата зависит от питания, возраста, физической нагрузки.

Зависимость скорости ферментативной реакции субстрата выражается уравнением Михаэлиса-Ментен:

V_max – максимальная скорость реакции

[S] – концентрация субстрата

K_m – константа Михаэлиса.

Анализ уравнения Михаэлиса-Ментен.

1. Концентрация субстрата мала, стремиться к нулю. При этих условиях [S] можно пренебречь:

[S] 0, при этом [S] можно пренебречь:

2. Концентрация субстрата стремится к бесконечности, пренебрегаем K_m и уравнение имеет вид:

Сокращаем на [S] и скорость реакции равняется V_max.

3. Если принять, что , то из уравнения Михаэлиса-Ментен, разделив его на V_max, получили K_m=[S]:

и разделив на V_max получим . Решая уравнение относительно K_m получаем K_m+[S] = 2[S],

K_m=[S]

K_m – величина, численно равная концентрации субстрата при , выраженная в молях. K_m = 10^-1 – 10^-6 – для клеток организма, величина const.

K_m показывает:

1. Степень сродства между ферментом и субстратом, существует обратная зависимость – чем меньше K_m, тем больше сродство F к S.

2. K_m позволяет определить какой субстрат будет превращаться под действием данного фермента:

Например, этиленгликоль – составная часть антифриза и алкагольдегидрогеназа (АДГ) будет превращать его в щавелевую кислоту, которая является ядом для печени.

Алкагольдегидрогеназа превращает этиловый спирт в уксусный альдегид и степень сродства АДГ к С₂Н₅ОН выше, чем к этиленгликолю и на этом основан способ нейтрализации этиленгликоля.

3. K_m показывает степень сродства между белковой и небелковой частью F,

4. K_m позволяет определить вид ингибирования.

Способ определения K_m .

1. Построение график Михаэлиса-Ментен:

I участок – с увеличением концентрации субстрата увеличивается скорость ферментативной реакции

II участок – с увеличением концентрации субстрата скорость реакции не изменяется, т.к. все активные центры заняты.

Недостаток графика Михаэлиса-Ментен при определении K_m заключается в том, что V_max достигается с трудом, реакции в клетке протекают с оптимальной скоростью, а не V_max.

2. Построение графика Лайнуэвера-Бэрка – метод обратных величин

Преимущество метода заключается в том, что прямую можно построить по двум точкам и нет необходимости определять максимальную скорость.

Зависимость скорости ферментативной реакции от концентрации фермента.

Зависимость носит линейный характер. Скорость химической реакции, катализируемой данным ферментом прямопропорциональна к онцентрации фермента. При этом концентрация субстрата величина постоянная. Это обясняетя большим количеством активных центров при определенном количестве молекул субстрата

Зависимость скорости ферментативной реакции от температуры.

При t=36-38⁰ ферменты обладают наибольшей активностью. Эта температура называется температурный оптимум:

С повышением t⁰ до оптимума активность ферментов повышается.

Высокие t вызывают денатурацию ферментов.

Низкие t снижают активность ферментов.

Изменение t⁰ приводит к нарушению связей, закрепляющих белковую структуру ферментов (третичную, четвертичную), т.е. вызывает денатурацию.

Обратимая денатурация наблюдается при понижении t⁰. Это позволяет хранить ферменты, биологические жидкости, кровь.

Повышение температуры необратимо нарушает белковую структуру фермента. Это свойство используется при стерилизации материалов, инструментов.

Лихорадка – защитное свойство организма, т.к. происходит денатурация ферментов микроорганизмов и поэтому нецелесообразно применять жаропонижающие средства.