3.1 Методы микробиологического контроля.

Методы микробиологического анализа можно разделить на два типа: количественные, предусматривающие подсчет микроорганизмов в пробе, и качественные, позволяющие выявить присутствие или отсутствие микроорганизмов в исследуемой пробе. Традиционные методы (посев на чашки Петри, в среду Кесслер и прочее), применяемые при проведении микробиологических исследований, основаны на введении пищевого продукта в питательную среду, в которой микроорганизмы могут развиваться и расти. Такие методы просты, удобны, дешевы, не требуют сложного оборудования, с их помощью легко количественно определить микроорганизмы различных групп, но они имеют существенный недостаток – длительность и трудоемкость. В целях модернизации и совершенствования микробиологических методов контроля разработаны усовершенствованные методы количественного подсчета микроорганизмов, например, пластины 3М Petrifilm Plates, подложки Rida Count. Применение подобного типа пластин представляет собой инновационный подход к решению проблем, связанных с проведением больших количеств микробиологических анализов /1.1/.

В последние годы появились новые ускоренные методы (экспресс-методы) микробиологического контроля, основной целью которых является сокращение времени проведения анализа и снижение трудоемкости процесса /1.1/:

• кондуктометрический;

• биолюминесцентный;

• метод микроскопии;

• иммунологический (иммуноферментный);

• метод ПЦР.

Микробиологический контроль молока и молочных продуктов с применение микробиологических пластин и подложек

Пластины 3М Petrifilm Plates представляют собой готовые к использованию микробиологические системы, в состав которых входит культуральная среда, растворимый в холодной воде гелеобразующий реагент и индикатор, цвет которого меняется в результате развития исследуемого микроорганизма, что облегчает подсчет колоний (рисунок 1.1).

Рисунок 1.1 – Структура пластин 3М Petrifilm Plates

Разработаны пластины, предназначенные для определения КМАФАнМ, БГКП, энтеробактерий, стафилококков, листерий, дрожжей и плесневых грибов.

Поле для идентификации образца

Разметка для подсчёта колоний

Питательная среда

Защитная плёнка

Подложки Rida Count изготовлены из материалов, пропитанных специально подобранными питательными средами, позволяющими идентифицировать определенный вид микроорганизмов (рисунок 1.2).

Стерильность подложки обеспе-

Рисунок 1.2 – Структура подложки Rida Count

чивается непроницаемой мембраной, снимающейся

перед выполнением анализа. В верхней части имеется цветная полоса, которая, во-первых, указывает на тип подложки, а во-вторых, является полем для идентификации пробы.

С помощью ножниц открывают фольгированный пакет с подложками, извлекают из открытого пакета необходимое количество подложек. Затем фломастером наносят на прозрачную пленку подложки идентификатор пробы или любую дополнительную информацию о ней (например, кратность разведения). Пакет с оставшимися подложками закрывают и помещают в холодильник при температуре 2-8°С. Далее снимают прозрачную пленку подложки и проводят микробиологическое исследование.

Вносят 1 см³ исследуемого образца (либо разведения образца), выдерживают несколько минут для равномерного распределения образца по подложке, после чего подложку закрывают защитной пленкой (рисунок 1.3 б, в).

После проведения микробиологических исследований подложки помещают в термостат и инкубируют при температуре, оптимальной для развития исследуемых микроорганизмов (рисунок 1.3 г). Подложки допускается термостатировать сложенными в стопки по 20-30 штук, за исключением подложек для определения дрожжей и плесневых грибов, которые должны быть сложены в стопки не боле 2-3 штук.

а)

б)

в)

г)

а - приготовление серийных разведений образца;

б - нанесение 1 см³ образца (или его разведения) в центр пластины;

в - распределение образца по поверхности пластины при помощи специального распределителя; г- инкубация пластин в термостате

Рисунок 1.3 – Последовательность проведения микробиологических определений с использованием пластин и подложек

По истечении времени инкубации подсчитывают колонии, выросшие на всей подложке. Если количество колоний на подложке слишком велико для подсчета, выбирают несколько наиболее представительных квадратов (согласно разметке на защитной пленке подложки), подсчитывают количество колоний в квадратах. Затем с помощью специально разработанных таблиц определяют количество колоний на всей площади подложки – 20 см².

Определение бактериальной обсемененности с использованием биолюминесцентного экспресс-метода

Люминесцентная микроскопия основана на способности многих веществ биологического происхождения светиться под воздействием падающего на них света. Молекулы веществ, способных к люминесценции, поглощают энергию падающего света и на непродолжительное время переходят в возбужденное состояние, которое характеризуется более высоким энергетическим уровнем. Обратный переход в нормальное состояние сопровождается отдачей избытка энергии в виде света – люминесценцией. Как правило, для возбуждения люминесценции объект освещают УФ-лучами длиной волны 300-400 нм или сине-фиолетовыми лучами с длиной волны 400-460 нм. Способностью к люминесценции обладает АТФ (аденозин-5¹-трифосфат), содержание которого зависит от количества бактериальных клеток. Измерение люминесценции микробной АТФ производят на приборах –люминометрах /1.1/.

Измерительный комплекс прибора представляет собой сочетание люминометра и специальных реактивов. Люминометр детектирует интенсивность излучения, возникающего в ходе реакции биолюминесценции (относительные световые единицы – RLU), которая прямо пропорциональна количеству АТФ. АТФ содержится во всех живых клетках – растительных, животных и клетках микроорганизмов, и именно поэтому АТФ является интегральным показателем чистоты. Люминометр выдает результат в течение 1 мин, что дает возможность внести коррективы перед пуском производственной линии, то есть работать в режиме online. К достоинствам метода определения АТФ, кроме быстроты, можно отнести высокую чувствительность, воспроизводимость результатов и простоту, так как он не требует пробоподготовки.

Метод АТФ-тестирования можно использовать как экспресс-метод определения качества санитарной обработки оборудования, чистоты рук персонала. Кроме того, данный метод можно использовать также для определения соматических клеток в молоке, бактериальной обсемененности сырого молока и воды, колиформных бактерий в пищевых продуктах и воде, остаточных количеств некоторых групп антибиотиков (бета-лактамов, левомицетина, клоксациллина, тетрациклина, сульфамидов).

Люминометр «System Sure II» представляет собой экспресс-систему микробиологического анализа методом АТФ-биолюминесценции и состоит из измеряющего аппарата «System Sure II» и тест-системы «Ultrasnap ATP для взятия проб, содержащей набор биолюминесцентных реагентов, за исключением АТФ, необходимых для протекания люциферазной реакции.

Принцип работы люминометра основан на измерении количества АТФ - химического вещества, присутствующего во всех живых клетках, в том числе микробных, посредством использования тест-системы, содержащей фермент люциферазу, которая усиливает реакцию между люцифирином и АТФ микробной клетки и дает эффект свечения, пропорциональный степени загрязненности образца.

Отбор проб с помощью тест-системы «Ultrasnap ATP». Тест-система «Ultrasnap ATP» для взятия проб состоит из полимерной пробирки с вставленным в нее полым стержнем, на верхней стороне которого находится полимерная груша с биолюминесцентным реагентом, на нижней стороне - тампон для протирания поверхностей.

Отбор проб для исследований проводят с соблюдением правил асептики. Смывы берут с поверхности площадью приблизительно 100см² стерильным увлажненным тампоном, расположенным на конце полой трубки,

Аппарат имеет следующие технические особенности, представленные на рисунке 1.4.

1 - крышка аппарата; 2 - жидкокристаллический экран; 3 – клавиатура; 4 - лицевая этикетка; 5 - место для закрепления шнурка; 6 - табличка серийного номера; 7 - место для батареек; 8 - крышка соединителя RS 232; 9 - защитный карман и пространство для вставки образца

Рисунок 1.4 – Описание люминометра «System Sure II»

удерживая ее за полимерную грушу. После взятия смыва полимерную трубку с тампоном вновь помещают в полимерную пробирку. До активации тест-системы «Ultrasnap ATP» проба может храниться в пробирке до 4-х часов, после активации ее необходимо помещать в люминометр не позднее чем, через 60 секунд.

Для проверки жидких проб, таких как вода, тампон необходимо погрузить в пробу на 5-10 секунд.

Активация тест-системы «Ultrasnap ATP» происходит путем нагибания полимерной груши вперед и назад несколько раз. После 2-х кратного нажатия на грушу, биолюминесцентный реагент, находящийся в ней стекает по полой полимерной трубке вниз пробирки, смачивая тампон. Для лучшего увлажнения тампона реагентом, пробирку встряхивают в течение 5-10 секунд.

Измерение оптических параметров с помощью люминометра. Перед измерением оптических параметров люминометр после включения осуществляет внутреннюю самокалибровку в течение 60 секунд. Во время самокалибровки в приборе не должно быть тест-системы и крышка устройства должна быть закрыта. После завершения автоматической самокалибровки прибор готов для выполнения измерений.

Для измерения оптических параметров активированную тест-систему «Ultrasnap ATP» строго вертикально вставляют в люминометр, закрывают крышку и нажимают кнопку «ОК» на передней панели прибора. Измерение оптических параметров проводят не позднее, чем через 60 секунд после взятия пробы. Считывание результата измерений осуществляют в течение 60 секунд периода активации.

Результаты измерений оптических параметров при тестировании методом АТФ-биолюминометрии выражаются в относительных световых единицах (RLU) и показывают общее количество света, испускаемое в пробе в результате реакции биолюминесценции (формулы 1, 2).

1 RLU = 1 fmol, (1)

1 fmol = 10¹⁵М, (2)

где RLU - относительная световая единица;

fmol - фемтомоль вещества;

М - моль вещества.

Порядок проведения микробиологического исследования с применением люминометра схематически представлен на рисунке 1.5.

Рисунок 1.5 – Порядок проведения микробиологического исследования с применением люминометра

Оценку полученных результатов испытаний проводят с не установленными пороговыми значениями или с установленными пороговыми значениями.

При работе с не установленными пороговыми значениями результаты испытаний оценивают следующим образом: результат < 10 свидетельствует о том, что поверхность является чистой; результат от 11 до 29 свидетельствует о том, что поверхность не является адекватно чистой; результат > 30 свидетельствует о том, что поверхность является грязной.

При работе с установленными пороговыми значениями (верхнее и нижнее) последние следует устанавливать в соответствии со стандартами конкретного предприятия по специально разработанным методикам. При этом результаты испытаний оценивают следующим образом: значение

< нижнего порога обозначает положительный результат; значение > нижнего порога, но < верхнего порога обозначает предупреждающий результат; значение > верхнего порога обозначает отрицательный результат.