3.Разработка параметров обогащения и скрининг-тестов.

4.Источник м/о:

А) проба из природных источников (ледники, сточные воды, олиготрофные озера). Ацидофилы (кислая рН), алкалофилы (щелочная рН), термофилы, антифризные м/о (образуют кристаллы льда), углеводоокисляющие.

Б) коллекция культур м/о. Актиномицеты (а/б), бациллы (внеклеточные ферменты), дрожжи (этанол).

5.Выделение требуемого м/о. Из природных источников на селективные среды – накопительная культура. Так был выделен штамм бактерии Agrobecterium, который способен расщеплять феррат ЭДТА в [100 ммоль], ибо сам он расщепляться не может. Алкалофильные – стиральный порошок. Термофильные растут на новом уплотнителе (Gelrite), который продуцируют Ps. Олиготрофы из олиготрофных озер в Антарктике.

6.Первичный скрининг (отбор организмов с требуемыми свойствами). Прямые (визуальная идентификация) и непрямые (ВЭЖХ, газовая хроматография, ЯМР, масспектрометрия, колометрия) методы. Биотесты – Цефалоспорин С -(-ацелаза)- 7-аминоцефалоспорановая кислота (источник а/б ряда цефалоспоринов). Используют индикаторный организм, который устойчив к Цефалоспорину С, но чувствителен к кислоте. Бензинпенициллин –(пенициллиназа)- 6-аминопенициллановая кислота. Индикатор – Seracia marcescens.

7.Повторный скрининг (del клонов с ложно «+» и «-» рез-ми. Прямые и непр. методы. Оценка акт-ти.

8.Улучшение продуцента (оптимизация). ↑стабильности фермента или субстрат - специфичность.

9.Масштабирование (лабораторные, пилотные, промышленные б/реакторы).

10.Производство.

№10

2010/2011 Учебный год

1.Общая характеристика способов генетического обмена у бактерий.

Наряду с бесполым способом передачи генов от предков к потомкам существует и парасексуальный процесс передачи генетического материала (горизонтальный перенос генов), который отличается от полового размножения тем, что здесь не происходит слияние двух половых клеток (гамет) и образования зиготы. При парасексуальном процессе из клетки-донора в клетку-реципиента передается часть генетического материала (хр.), в результате образуется неполная зигота или мерозигота. Затем переданный фрагмент хр. донора спаривается с хр. реципиента и происходит рекомбинация. За рекомбинацией следует процесс репликации ДНК и деления клетки, в результате возникают клетки, содержащие только рекомбинантную хр. (рекомбинанты). Существуют три основных способа обмена генетической информацией: трансформация, трансдукция и конъюгация. Отличаются друг от друга способом транспортировки ДНК.

Трансформация – это процесс переноса генетической информации, при котором ДНК, выделенная из клетки-донора, поступает в клетку-реципиент. Начальным этапом генетической трансформации является необратимая адсорбция ДНК на поверхности клетки и поглощение этой ДНК. К необратимой адсорбции и поглощению ДНК способны лишь клетки бактерий, находящиеся в состоянии компетентности. Последующие этапы, как и при других парасексуальных процессах, связаны с рекомбинацией трансформирующей хромосомной ДНК донора с хромосомой реципиента и пострекомбинационными событиями. Рекомбинанты - трансформанты. Количество переносимой при трансформации ДНК = в ср. ок. 10 т.п.о. Генетическая трансформация у бактерий может осуществляться не только хромосомной, но и плазмидной ДНК. Может происходить и за счет ДНК, спонтанно вышедшей из клетки. Это естественная трансформация. Выход ДНК из клетки обусловлен г.о. автолизом. Т.о., при естественной трансформации бактерия-донор ДНК обязательно погибает. Один из механизмов горизонтального переноса генов в природных условиях.

Трансдукция – это перенос генетической информации (хр. генов или плазмид) от клетки-донора к клетке-реципиента, который осуществляется б/фагами. Хр. гены или плазмиды должны упаковаться в головку б/фага; выйти, в составе этой фаговой частицы, из лизированной клетки-донора; попасть в клетку-реципиент при новом акте заражения. Белковый капсид фаговой головки предохраняет находящуюся в ней ДНК от разрушения внеклеточными нуклеазами. В этом отношении трансдуцирующая ДНК более «сохранна», чем «голая» ДНК при трансформации. Поскольку адсорбция хвостового отростка фага к рецепторам поверхности клетки видоспецифична, то перенос генетического материала при трансдукции может происходить г.о. у близкородственных бактерий. При трансдукции размеры переносимого фрагмента ДНК определяются размерами головки б/фага. Различные фаги могут переносить от 20 до 40 т.п.о. ДНК. Т.о., при трансдукции передаются как единичные признаки, как и сцепленные маркеры. Рекомбинанты-трансдуктанты.

Конъюгация - процесс генетического обмена, сопровождающийся переносом генетической информации от клетки-донора к клетке реципиента, который осуществляется при непосредственном контакте клеток между собой. При конъюгации перенос генетического материала обеспечивается конъюгативными плазмидами, такими как плазмида F у бактерий E.coli. Конъюгативные плазмиды содержат tra-гены, ответственные за перенос генетического материала. Ряд tra-генов определяет синтез половых пилей; другие отвечают за перенос самой плазмиды или мобилизацию переноса хр. ДНК из клетки в клетку. Передача плазмиды или хр. начинается с однонитевого разрыва в области оriT плазмиды. Для того, чтобы произошла передача хромосомных генов плазмида F (или др. конъюгативная плазмида) должна интегрироваться в хр. Разорванная в области оriT нить ДНК разматывается, и ssДНК, начиная с 5'-конца, переносится в реципиентную клетку. Одновременно на обеих нитях пл. и хр. ДНК – и той, которая остается в донорной клетке, и той, которая поступила в клетку-реципиент, – синтезируется комплементарная нить. Благодаря этому в клетке-доноре восстанавливается целостность хр. и F-плазмиды. Заключительной стадией передачи F-плазмиды является рециркуляризация ее ДНК в клетке-реципиенте, а передачи хр. ДНК – рекомбинация ее с хр. реципиента. Процесс переноса хр. генов при конъюгации может осуществляться также при участии содержащихся в хр. конъюгативных транспозонов. Такие транспозоны кроме генов, отвечающих за транспозицию и генов, детерминирующих фенотипические признаки, несут tra-гены, похожие на соответствующие гены конъюгативных плазмид. Конъюгативные транспозоны могут выщепляться из хр., образовывать плазмидоподобные структуры и, как и конъюгативные пл., индуцировать перенос мелких плазмид в клетку партнера, а также самим переходить в нее. Это наилучший механизм в любой среде обитания бактерий. Конъюгировать могут бактерии, весьма далекие в систематическом отношении. Плазмиды, осуществляющие конъюгацию между неродственными бактериями и успешно поддерживающиеся в них, как мы уже отмечали, называют плазмидами широкого круга хозяев. Количество переносимой ДНК при конъюгации больше, чем при трансформации и трансдукции. В «мягких» условиях скрещивания может переноситься вся хр. Рекомбинанты - трансконъюганты.

Общим для всех способов обмена генетической информацией у бактерий является следующее:

1. Процесс переноса ДНК всегда односторонний или однонаправленный, от донорных бактерий к реципиентным.

2. Не наблюдается полного обмена генетической информацией. Образуется мерозигота:

Состояние мерозиготы не длительное. Экзогенота должна встроится в эндогеноту. Если этого не происходит, то экзогенота элиминируется эндонуклеазами клетки-реципиента.

3. Процесс переноса должен закончится рекомбинацией.

Слияние бактериальных протопластов или сферопластов. Это так называемый искусственный обмен генетической информацией, так как здесь участвуют не интактные клетки, а протопласты или сферопласты. Сначала получить протопласты или сферопласты из клеток обоих родителей, а затем смешать и индуцировать их слияние путем обработки ПЭГ. Первичный продукт такого слияния – клетка, объединяющая в себе геномы обоих родительских клеток. Слившиеся протопласты или сферопласты высевают на специальные среды, на которых создаются условия для регенерации их в морфологически полноценные клетки. В процессе последующей рекомбинации возникают стабильные рекомбинанты, обладающие некоторыми признаками обоих родительских штаммов. Метод слияния протопластов или сферопластов пока успешно применяется только в отношении грамположительных бактерий. В последнее время разработаны условия для слияния сферопластов таких грамотрицательных бактерий, как Pseudomonas, Erwinia и др. В отличие от конъюгации, трансформации и трансдукции, при которых ДНК передается от донора реципиенту, перенос генетической информации при слиянии протопластов или сферопластов не носит однонаправленного характера, родительские клетки равноценны.

2-Механизмы, определяющие избирательное действие ксенобиотиков.

Способность воздействовать на структуры клетки, ткани, организма в целом, но не влиять на другие, даже если они находятся в непосредственном контакте с первыми.

3 основных механизма:

1. Ксенобиотик может избирательно распределяться и накапливаться в органах и тканях. Гербициды контактного действия (у сорняков листья опушенные, а у злаков гладкие). Есть ксенобиотики, которые могут накапливаться только в ороговевших частях, так можно бороться с грибками.

2.Ксенобиотик может вмешиваться в биохимические процессы. Могут образовываться более токсичные продукты

3. Ксенобиотик может воздействовать только с определенными клеточными структурами. У растений клеточная стенка состоит из гемицеллюлозы и целлюлозы, у бактерий из муреина.

Свойства самого ксенобиотика:

1. Степень ионизации. Какова степень ионизации, таково и взаимодействие

2. Ковалентная реакционная способность (ксенобиотик может быть активным, а может и нет)

3. Транспорт через мембрану. Есть специфические эффекты – когда на мембране есть специализированный мест связывания, и такие эффекты другой агент вызывать не может. Не специфическое – разные агенты вызывают одно и тоже изменение.

З.Водоросли, их отличие от высших растений. Основные типы морфологической структуры тела. Параллелизм эволюционного развития в пределах отделов.

Царство Algae. Ок. 40000 видов, 10 отделов. Водоросли – это группа низших талломных (слоевищных) автотрофных организмов, преим-но водных, кот. размножаются в осн. спорами. У нек. автотрофное + гетеротрофн. питание. Тело м.б. 1#, колониал., талломом (много#). Размеры: от неск. мкм до 70-80 м. Внешний вид: ризоиды, стволовая часть и листовые структуры. В крупных талломах есть зачатки тканей. Т.е. нет разделения на корень, стебель и листья – самые примитивные из растений.

Ступени морфологической дифференциации таллома:

1) амебоидная (ризоподиальная) стр-ра – # не покрыты тверд.оболочкой, м. давать выросты (псевдоподии); от амебы отличаются наличием хроматофора (хлоропласты) с пигментами; м. питаться авто- и гетеротрофно; характерна для немногочисленных водорослей.

2) монадная (жгутиковая) – 1# и колон.формы; им. жгутики (1,2 или неск.)=>акт.движени в воде; характ. для многих водорослей (вольвокс), > у пирофит., золотист. и эвглен. У вышеорганизованных такой стр-рой обладают кл. для размножения – бесполого (зооспоры) и полового (гаметы).

3) пальмеллоидная (капсальная) – неподвижные кл., погруженные в общую слизь, удаленные 1 от др., т.е. не имеющих плазматич.связей (золотистые, зеленые водоросли).

4) коккоидная (осн. стр-ра) – неподвижные, им. хорошо выраженную целлюлозную оболочку кл., одиночные или собраны в колонии (хлорелла). + у зел., синезел., золот., диатомовых.

5) нитчатая (трихиальная) (осн. стр-ра) – неподвижн. кл., соединенные в нити, м/у кот. осущ-тся физиологич. взаимод-е с помощью плазмодесм.; кл. нити непрерывно делятся поперечными перегородками, обеспечивая нарастание ее в длину, растет в 1 направлен., кл. не расходятся (ультрикс).

6) разнонитчатая (гетеротрих.) – 2 с-мы нитей: стелющиеся по Sub и отходящие от них вертикально. (сфацелярия).

7) пластинчатая (тканевая) – в результате деления кл. нити не только в поперечном, но и в продольном направлении возникают талломы в виде паренхиматозных пластинок, т.е. кл. делятся в одной плоскости в перпендикулярных направлениях (ульва).

8) сифональная – обр. в результате разрастания 1 кл., Я делятся, перегородки не образуются; часто крупные талломы со значительной внешней расчлененностью – 1 многоЯ кл. – неклеточное строение (сифоновые водоросли).

9) сифонокладальная – сначала образуется сифональная, потом идет деление протопласта, вокруг кот. формируется толстая кл. оболочка (кладофора).

10)харовитная –мутовчато-разветвленн.таллом, напоминает хвощи (харовые):гл побег,листья,ризоиды.

КЛЕТКА: от мкм до 25 см, у примитивных им. монадную организацию, а также зооспоры и гаметы им. «голые» кл., окруженные тока ЦПМ, у > высших есть КС, кот. образована гемицелл. и пектиновым матриксом, в кот. погружены чаще всего целл. м/фибриллы, ориентированные опр. образом. Она м.б. цельной / состоять из 2 и > частей, пронизана порами, м. нести разл. выросты, м. б. покрыта слизью (защитная ф.); м.б. покрыта перипластом (эвглена), если он эластичен, то кл. м. сжиматься и вытягиваться; м.б. тека – плотная оболочка, пропитанная солями железа и др., кот. сост. из целл. пластинок. М. сост. из CaCO₃ (золотистые), соед. Si (диатомовые). В сине-зеленых и монадных нету большой центральной вакуоли; м. б. много Я, чаще всего они гаплоидные; закрытый митоз (Я оболочка не разрушается при делении Я, происходит перетяжка после деления хр.); дино- и мезокарионы (крупные Я, в хр. нет гистонов, в интерфазе такие хр. хорошо видны); у цианобактерий нету Я, есть нуклеоид, нет гистонов; В кл. (за искл. сине-зел.) хорошо заметны хроматофоры, кот. отличаются от хлоропластов по кол-ву, по форме, по анатомическому строению; под его оболочкой (в матриксе) есть тилакоиды, кот. окружены М, в кот. нах. пигменты (хлорофилл и каротиноиды). В матриксе хроматофора нах. рассеянные Л гранулы и особые включения – пиреноиды (там крахмал). Тилакоидов много, сгруппированы в ламеллы. Различная окраска обусловлена наличием хлорофилла а и b (у высших), c, d, e; каротиноидов α, δ, γ, ε; ксантофиллов (ок. 30), билипротеинов (трихоцианин –синий, фикоэритрин – красный).

РАЗМНОЖЕНИЕ: 1) вегет. (1# - дел.клетки; фрагментация таллома у нитчат. форм; у.нек - клубеньки, акинеты – орг. разм) 2) бесполое – обр-тся споры в спец. спорангиях (зооспоры – со жгутиками у хламидомонады; апланоспоры – без них у бурых);

3)половое – хологамия (копуляция 2х 1#особей), гаметогамия: изогамия (одинак.), гетерогамия (разл. разм.), оогамия (мужские гаметы м. б. без жгутиков – спермации); конъюгация (сливаются протопласты вегетативных кл: м/у кл. обр. трубчатый отросток и протопласты переливаются). Гаметангии, где обр-тся гаметы :оогонии (яйц), антеридии (сперм).У мн. – черед.покол.- спорофита и гаметофита.

№11